重組人生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠膽道梗阻-再通的防治作用

齊慶安，祝建勇，王錦波

梗阻性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是臨床上各種原因引起的肝外膽管阻塞后所發(fā)生的膽汁瘀積癥，由于膽汁瘀積，常可導(dǎo)致復(fù)雜而嚴(yán)重的全身性病理生理改變。傳統(tǒng)的圍手術(shù)期治療方法療效欠佳，而重組人生長(zhǎng)激素（recombinant human growth hormone，rhGH）在OJ時(shí)對(duì)肝損害的防治作用的研究報(bào)道很少。本研究采用膽道梗阻-再通大鼠模型，觀察應(yīng)用重組人生長(zhǎng)激素后動(dòng)物血生化和血清TNF-α的變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 6～8周齡Spragure-Dawley大鼠，雌雄不限，體重180～220 g，隨機(jī)將大鼠分為3組。A組：假手術(shù)組（sham operation），只游離出膽總管但不結(jié)扎，7 d后再次開(kāi)腹分離粘連后關(guān)腹；B組：膽道梗阻（common bile duct ligation，CBDL）-再通（bile duct reconstruction，BDR）組，開(kāi)腹游離出膽總管，3-0號(hào)絲線雙重結(jié)扎，術(shù)后第7天再次開(kāi)腹，行內(nèi)引流術(shù)，同時(shí)，從術(shù)后第1天開(kāi)始，每日皮下注射等體積的0.9%NaCl；C組：膽道梗阻-再通-rhGH注射組，手術(shù)方式同B組，從術(shù)后第1天開(kāi)始，給予rhGH（瑞士Serono大藥廠生產(chǎn)Saizen，4U/支）0.5U/kg皮下注射，1次/d，直至動(dòng)物被處死。分別在A、B、C 組大鼠第一次手術(shù)后 1、3、7、10、14 d 5 個(gè)時(shí)相點(diǎn)（每個(gè)時(shí)相點(diǎn)保證有6只動(dòng)物），于下腔靜脈穿刺取血4～5 ml，4℃，3 000×g 離心 15 min，取上清置于-70℃冰箱保存待測(cè)。采血后，經(jīng)門(mén)靜脈灌注0.9%NaCl注射液沖去血液，取肝組織，在10%甲醛水溶液中固定12～24 h再修剪成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm組織塊；另在3%戊二醛水溶液中修剪成0.5mm×0.5mm×0.5 mm的組織塊，固定2～4 h，備電鏡檢查。

1.2 生化檢測(cè) 采用北京中山公司提供的谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試劑盒（賴(lài)氏法）檢測(cè)ALT的變化，總膽紅素檢測(cè)試劑盒（重氮法）檢測(cè)TBIL的變化，采用上海長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科技有限公司提供的總膽汁酸檢測(cè)試劑盒（循環(huán)酶法）檢測(cè)TBA的變化，采用解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所提供的腫瘤壞死因子α檢測(cè)試劑盒（放免法）檢測(cè)TNF-α的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料求出±s，應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間均數(shù)的比較采用雙因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 SD大鼠術(shù)后一般情況 B組術(shù)后7 d存活率為88.0%（88/100），死亡的12只動(dòng)物中因麻醉意外死亡1只，膽漏2只，全身衰竭9只；膽道再通術(shù)后7 d存活率為69.2%（36/52），死亡的16只中麻醉意外3只，全身衰竭4只，出血4只，術(shù)后膽漏繼發(fā)腹腔內(nèi)感染5只。B組術(shù)后14 d大鼠累積死亡率為41.9%（13/31），與C組的累積死亡率14.3%（3/21）相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.2 血清ALT、TBIL及TBA水平變化 B、C組CBDL術(shù)后 ALT、TBIL、TBA 水平顯著升高（P<0.01），BDR術(shù)后上述指標(biāo)逐步好轉(zhuǎn)，至術(shù)后14 d時(shí)接近但仍顯著高于A組水平（P<0.05）；給予rhGH的C組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的改善明顯優(yōu)于0.9%NaCl注射的B組，隨用藥天數(shù)的增加，效果更趨明顯，特別是在術(shù)后14 d ALT水平已回落至A組水平，并顯著低于B組（P<0.05）。

2.3 血清TNF-α的水平變化 B、C組CBDL術(shù)后TNF-α濃度上升，隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，與A組逐漸出現(xiàn)非常顯著的差異（P<0.01）。BDR術(shù)后TNF-α逐漸下降，C組下降更為顯著（P<0.05），于術(shù)后7 d達(dá)到A組水平，且與B組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清TNF-α水平（ng/ml，±s）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間血清TNF-α水平（ng/ml，±s）

與 A 組比較，*P<0.05，**P<0.01；與 B 組比較，#P<0.05，##P<0.01

時(shí)相點(diǎn) A組 B組 C組術(shù)后 1 d 0.95±0.19 1.23±0.38* 1.26±0.40*術(shù)后 3 d 0.89±0.15 1.46±0.48* 1.34±0.48*術(shù)后 7 d 0.94±0.17 4.14±0.70** 3.83±0.63**#術(shù)后 10 d 0.92±0.18 3.23±0.71** 1.67±0.21*##術(shù)后 14 d 0.96±0.19 1.38±0.29* 0.93±0.15#

2.4 膽道梗阻-再通術(shù)后肝臟病理形態(tài)學(xué)改變 A組大鼠呈正常肝小葉結(jié)構(gòu)。B、C組大鼠CBDL術(shù)后肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，肝細(xì)胞淤膽，中央靜脈周?chē)渭?xì)胞內(nèi)可見(jiàn)無(wú)折光性、棕褐色膽色素顆粒沉積，隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞內(nèi)色素顆粒增大更加顯著，部分肝細(xì)胞濁腫變性、壞死，部分肝細(xì)胞脂肪變性。匯管區(qū)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小膽管增生，膽栓形成（圖1）。膽道再通術(shù)后，匯管區(qū)仍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞壞死少見(jiàn)，總體上解除梗阻后病理改變明顯減輕（圖2）。

透射電鏡觀察顯示，A組肝細(xì)胞形態(tài)正常。B、C組CBDL術(shù)后肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松，核圓縮，線粒體明顯腫脹，嵴斷裂、減少，基質(zhì)透明性變，以致線粒體呈空泡狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，毛細(xì)膽管管徑增加（圖3）。BDR術(shù)后肝細(xì)胞線粒體仍顯著腫脹，微絨毛數(shù)量增加，毛細(xì)膽管腔內(nèi)可見(jiàn)散在微絨毛膜泡。C組肝細(xì)胞線粒體腫脹、毛細(xì)膽管擴(kuò)張以及單位面積微絨毛數(shù)量減少均較B組減輕，至術(shù)后14d時(shí)，肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管形態(tài)恢復(fù)較好，微絨毛數(shù)量明顯增加（圖4）。

圖1 CBDL術(shù)后7 d肝組織學(xué)改變（HE×400）匯管區(qū)見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，小膽管增生

圖2 BDR術(shù)后7 d肝組織學(xué)改變（HE×400）肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)疏松，匯管區(qū)見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，小膽管增生，肝細(xì)胞壞死減少

圖3 B組膽道梗阻術(shù)后7 d超微結(jié)構(gòu)改變（×10 000）肝細(xì)胞線粒體腫脹，基質(zhì)密度減低呈空泡狀，嵴斷裂減少

圖4 C組膽道再通術(shù)后7 d超微結(jié)構(gòu)改變（×7 000）肝細(xì)胞線粒體腫脹減輕，基質(zhì)密度稍低

3 討 論

梗阻性黃疸是臨床上常見(jiàn)的疾病，患者術(shù)后容易發(fā)生急性胃黏膜病變、急性腎功能衰竭、免疫功能障礙乃至全身炎癥反應(yīng)綜合征、凝血機(jī)制紊亂甚至彌散性血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重并發(fā)癥，病死率亦居高不下。生長(zhǎng)激素是腦垂體前葉分泌的一種蛋白質(zhì)，由191個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其主要作用是促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和影響代謝，既往主要用于兒童生長(zhǎng)激素缺乏癥的治療，近年來(lái)隨著臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素具有促進(jìn)肝細(xì)胞、胃腸黏膜上皮細(xì)胞、燒傷后殘存上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖的能力[1]。目前已經(jīng)在腸瘺、慢性消耗性疾病及全胃腸外營(yíng)養(yǎng)支持治療中得到廣泛應(yīng)用，但在梗阻性黃疸中的研究尚缺乏[2～4]。

梗阻性黃疸常伴隨內(nèi)毒素血癥，而TNF-α是其毒性的主要執(zhí)行者。TNF-α可激活細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、 血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、前列腺素和白三烯等的分泌，激發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致所謂 “瀑布效應(yīng)”[5～7]。 本文結(jié)果顯示，TNF-α在CBDL術(shù)后1d即有明顯上升（P<0.05），并隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高，與假手術(shù)組逐漸出現(xiàn)非常顯著的差異（P<0.01），至術(shù)后第7天時(shí)B組TNF-α的水平為A組的4.4倍；同時(shí)其對(duì)肝臟的負(fù)面影響也逐漸加重，表現(xiàn)為ALT、TBIL、TBA的顯著升高，至術(shù)后第7天時(shí)分別增高為A組的3.2、34.3、18.4倍。rhGH的應(yīng)用降低了梗阻性黃疸時(shí)大鼠血清的TNF-α水平，減輕了肝組織損害，但直至術(shù)后第7天始顯著低于B組（P<0.05）。與此同時(shí)，rhGH部分改善了膽道再通術(shù)前大鼠的肝功能，血清 ALT、TBIL、TBA 水平均顯著低于 B 組（P<0.05），尤其后者更為顯著（P<0.01）。王向昱等[8]通過(guò)皮下注射rhGH治療重癥急性胰腺炎患者40例，亦發(fā)現(xiàn)rhGH能顯著降低急性壞死性胰腺炎胃腸黏膜組織炎性細(xì)胞因子、粘附分子與趨化因子的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其胃腸道局部抗炎作用。筆者認(rèn)為，此種“有益效應(yīng)”主要與rhGH能保護(hù)腸黏膜屏障，減少細(xì)菌移位和內(nèi)毒素吸收等有關(guān)。然而，rhGH并不能扭轉(zhuǎn)OJ時(shí)嚴(yán)重的病理生理改變，C組大鼠肝功能仍呈持續(xù)惡化趨勢(shì)，說(shuō)明解除膽道梗阻是首要因素。梗阻解除后，C組大鼠肝功能指標(biāo)以及TNF-α水平明顯低于同時(shí)相點(diǎn)的B組大鼠（P<0.05），至術(shù)后第14天時(shí)雖然TBIL與TBA仍顯著高于A組，但是ALT與TNF-α已恢復(fù)為正常水平，說(shuō)明rhGH能促進(jìn)OJ大鼠在BDR術(shù)后的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在52只行BDR手術(shù)的OJ大鼠中，有13只術(shù)前一般情況很差，黃疸嚴(yán)重，BDR術(shù)后7d內(nèi)死亡8只，死亡率高達(dá)61.5%，占全部術(shù)后死亡的50.0%（8/16），且大多數(shù)是未應(yīng)用rhGH的B組大鼠（6/8），說(shuō)明在影響OJ大鼠手術(shù)危險(xiǎn)性的因素中，TBIL以及TBA是重要的參考指標(biāo)，而rhGH能顯著降低OJ大鼠在膽道再通術(shù)前的TBIL、TBA水平，并顯著降低術(shù)后第14天大鼠累積死亡率（P<0.05），說(shuō)明rhGH能增強(qiáng)OJ大鼠的手術(shù)耐受性、提高安全性。Ram等[9]認(rèn)為rhGH可能通過(guò)JAK/STAT5通路上調(diào)淤膽時(shí)鈉-?；悄懰猁}共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（Na+-dependent taurocholate cotransporting polypeptide，Ntcp)的表達(dá)，從而起到“利膽”作用，但 rhGH對(duì)其它轉(zhuǎn)運(yùn)子，特別是對(duì)肝細(xì)胞毛細(xì)膽管面轉(zhuǎn)運(yùn)子的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

此外，筆者曾對(duì)重度OJ和淤膽性肝炎患者在用常規(guī)治療無(wú)法使黃疸減輕時(shí)，試用過(guò)rhGH治療，發(fā)現(xiàn)其具有較明顯的“利膽”作用。Sklar等[10]通過(guò)361例惡性腫瘤幸存患者接受rhGH治療后腫瘤復(fù)發(fā)情況的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的復(fù)發(fā)率僅為0.83%，繼發(fā)性腫瘤的發(fā)生率為3.21%，rhGH治療與患者的病死率也沒(méi)有明顯聯(lián)系。因此，對(duì)于長(zhǎng)期重度OJ，在解除梗阻的原則下，rhGH“利膽”、改善肝功能的作用可用于部分重癥患者的圍手術(shù)期處理。

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