響應(yīng)面分析法優(yōu)化從白扦中提取莽草酸工藝*

劉 玉，楊 磊

（1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163316；2.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040）

莽草酸為一種白色結(jié)晶性粉末，易溶于水，難溶于氯仿、苯和石油醚。具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，通過影響花生四烯酸代謝，可抑制血小板聚集，抑制動、靜脈血栓及腦血栓形成［1］。自禽流感疫情受到世界的普遍關(guān)注后，治療其特效藥物磷酸奧司米韋(Oseltamivir Phosphate)日益受到重視，而合成這種藥物的重要中間體就是莽草酸［2-6］。傳統(tǒng)的制備工藝都是從八角茴香中提取莽草酸的［7］，但由于八角茴香在全球僅少數(shù)地區(qū)才有分布，在我國只有4個省份生長，通常只在3-5月收獲［8］，資源極度缺乏，并且30公斤八角茴香只能加工出1公斤莽草酸，因此尋找新的莽草酸資源變得極為重要。國內(nèi)學(xué)者檢測到近20種針葉植物中含有莽草酸［9］，白扦是其中之一。白扦(Picea meyeri Rehd.Et Wils.)是中國特有的裸子植物［10］，常綠喬木，適應(yīng)性較強(qiáng)，生長速度快，為我國云杉屬中分布較廣的樹種之一。經(jīng)測定白扦針葉中莽草酸的平均含量達(dá)1.8%-2.6%，在不影響植物生長的前提下，適當(dāng)采摘針葉作為替代八角茴香作為分離莽草酸的原料，將可解決八角茴香資源匱乏的難題。

勻漿提取是指生物組織通過加入溶劑進(jìn)行組織勻漿或磨漿，以提取組織中有效成分的一種提取方法。該法一般應(yīng)用于從動物組織中提取氨基酸、蛋白質(zhì)等目的成分［11,12］。近年來，祖元剛等應(yīng)用勻漿提取法對植物組織中萜烯醇、黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取，收到了很好的效果［13-15］，將鮮物料置于勻漿機(jī)內(nèi)，與提取溶劑在勻漿裝置中混合，通過機(jī)械及液力剪切作用將物料撕裂和粉碎，使物料破碎和功效成分的提取同步進(jìn)行，達(dá)到對植物功效成分快速、強(qiáng)化提取的目的。勻漿提取法提取速度快，溫度低，能耗低，目的成分收率高。

近年來，國內(nèi)對于提取莽草酸的工藝進(jìn)行了深入的研究,但目前采用響應(yīng)面分析優(yōu)化從白扦中提取莽草酸工藝的研究罕見報道。本文利用勻漿法對白扦中的莽草酸進(jìn)行了提取，以莽草酸的提取率和純度為響應(yīng)值，對勻漿提取過程中的各因素采用響應(yīng)面法(Response Surface Methodology)進(jìn)行了優(yōu)化，取得滿意結(jié)果，為規(guī)模生產(chǎn)提供了有價值的工藝參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（美國Waters公司），包括 Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 717plus Autosampler，Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；勻漿萃取裝置 (本實驗室專利產(chǎn)品，專利號：ZL02275225.0，結(jié)構(gòu)圖見參考文獻(xiàn)［16］)；KQ-250 DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-1型水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；AB-104電子天平（瑞士梅特勒公司）；SHB循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品及試劑

白扦針葉，2007年9月采摘于內(nèi)蒙古赤峰經(jīng)本室聶紹荃教授鑒定，常溫通風(fēng)陰干，粉碎后過200～300 μm篩后備用；莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)，純度大于99%；色譜級甲醇（J&KChemical Ltd.），去離子水自制，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 分析方法

2.1.1 色譜條件

采用高效液相色譜（HPLC）方法檢測，其色譜條件為：0.01%硫酸水溶液，色譜柱為AichromBond-AQ C18(4.6mm×250mm，5μm)，流速 1.0mL/min，柱溫室溫（25℃），檢測波長 213nm，進(jìn)樣量10μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品20.000mg，用甲醇溶解并于10mL容量瓶中定容，得到濃度為2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。將標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋成不同濃度進(jìn)行HPLC檢測，對標(biāo)準(zhǔn)品濃度和峰面積進(jìn)行線性回歸，得 回 歸 方 程 ：y=31238537.5714x+416091.5333，r2=0.9993，且莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品在0.2-2mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 提取液中莽草酸含量的測定

提取液抽濾后計量濾液體積，然后取樣1mL用于HPLC測定莽草酸峰面積s，用標(biāo)準(zhǔn)曲線將s折算成濃度c，剩余溶液60℃減壓濃縮至干，計量浸膏質(zhì)量。然后將濃度c依式1計算莽草酸的收率Y，依式2計算莽草酸的純度P。

式中Y，收率%；P，純度%；c莽草酸的濃度（μg/mL）；V，提取液體積（mL）；M，原料質(zhì)量（g），m，浸膏質(zhì)量。

2.2 影響提取工藝效果的因素試驗

2.2.1 單因素試驗

分別準(zhǔn)確稱取白扦粉末各10g置于勻漿萃取裝置中，分別考察不同提取溶劑、提取料液比、提取時間、提取方法、提取溫度和提取次數(shù)等單因素對提取效果的影響，以確定提取因素變化范圍以及各因素的適宜值。

2.2.2 工藝優(yōu)化實驗

根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素影響試驗結(jié)果，選取提取溫度、提取時間和料液比作為考察對象，采用Design Expert 7.0統(tǒng)計分析軟件的響應(yīng)面分析法安排試驗，以獲取最適工藝參數(shù)。試驗采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗設(shè)計，試驗水平因素安排見表1。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Code levels of experimental factors

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 不同提取方法對莽草酸提取率和純度的影響按照2.2.1項中所述的方法，按照1:10的料液比加入100 mL的去離子水，分別以超聲（60 min）、回流（4 h）、勻漿（4 min）和溫浸（50℃，8 h）等不同提取方法對其進(jìn)行提取，然后計算出不同提取方法的收率和純度，其結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，勻漿提取莽草酸的收率和純度均較高，所以提取方法選擇勻漿提取。

圖1 不同提取方法對莽草酸收率和純度的影響Fig.1 The effect of different extraction methods on the extraction rate and the purity

3.1.2 不同提取溶劑對莽草酸提取率和純度的影響按照2.2.1項中所述的方法，按照1:10的料液比分別加入100 mL的去離子水、甲醇、乙醇和丙酮，勻漿提取4 min，然后計算出不同提取溶劑的收率和純度，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取溶劑對莽草酸收率和純度的影響Fig.2 The effect of different extraction solvents on the extraction rate and the purity

由圖2可見，采用去離子水作為提取溶劑莽草酸的收率和純度均明顯高于其它提取溶劑，所以提取溶劑選擇去離子水。

3.1.3 不同提取時間對莽草酸提取率和純度的影響

按照2.2.1項中所述的方法，按照1:10的料液比分別加入100 mL的去離子水，分別勻漿提取2、3、4、5和6 min，然后計算出不同提取時間的收率和純度，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同提取時間對莽草酸收率和純度的影響Fig.3 The effect of different extraction time on the extraction rate and the purity

由圖3可見，勻漿提取3 min莽草酸的收率和純度均較高，所以提取時間的進(jìn)一步優(yōu)化范圍確定為2～4 min。

3.1.4 不同提取料液比對莽草酸提取率和純度的影響

按照2.2.1項中所述的方法，分別以1:6、1:8、1:10、1:12和1:14的料液比勻漿提取3 min，然后計算出不同提取料液比的收率和純度，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同提取料液比對莽草酸收率和純度的影響Fig.4 The effect of different extraction ratio of materials to solvents on the extraction rate and the purity

由圖4可見，料液比1:10進(jìn)行提取莽草酸的收率和純度較高，確定提取的料液比優(yōu)化范圍為1:8～1:12。

3.1.5 不同提取溫度對莽草酸提取率和純度的影響按照2.2.1項中所述的方法，按照1:10的料液比分別加入100mL的去離子水，分別在20、30、40、50和60℃不同溫度下勻漿提取3 min，然后計算出不同提取溫度下的收率和純度，其結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同提取溫度對莽草酸收率和純度的影響Fig.5 The effect of different extraction temperature on the extraction rate and the purity

由圖5可見，在40℃溫度下提取莽草酸的收率和純度均較高，所以提取溫度選擇30～50℃為進(jìn)一步優(yōu)化范圍。

3.1.6 不同提取次數(shù)的確定

按照2.2.1項中所述的方法，按照1:10的料液比分別加入100 mL的去離子水在40℃勻漿提取3 min，再分別提取3次。由圖6可知隨著提取次數(shù)的增加，莽草酸的純度逐次降低，我們將4次提取的莽草酸回收率設(shè)定為100%，則第1次的回收率為82.45%；前兩次的累積回收率達(dá)98.31%；同時考慮到增加提取次數(shù)，會增加用水量，回收成本高，且隨著次數(shù)增加，雜質(zhì)成分提取較多，導(dǎo)致莽草酸的純度有所降低，因此綜合考慮，提取次數(shù)選擇兩次較合理。規(guī)模生產(chǎn)時亦可考慮提取兩次，后1次的提取液作為下一批次的提取溶劑使用，以降低成本。

圖6 提取次數(shù)對莽草酸提取效果的影響Fig.6 The effect of extraction times on the extraction rate and the purity

3.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化從白扦中提取莽草酸工藝的研究

3.2.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型

1～12號是析因試驗，13～17號是中心試驗。17個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5次，用以估計試驗誤差。由Box-Behnken設(shè)計方案所得結(jié)果如表2。在選擇優(yōu)化條件實驗中設(shè)置了莽草酸收率和純度雙響應(yīng)值來篩選最佳提取工藝。

表2 響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果分析Table 2 Response surface design and experimental results

對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多項擬合回歸，以高效液相色譜檢測到的峰面積計算出的收率（Y）和純度（P）為因變量，溫度(X1)、時間(X2)、料液比(X3)為自變量，建立回歸方程如下：

回歸方程可信度分析見表3，其中提取率和純度的R2分別為98.65%和97.48%。表明超過90%的實驗數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋，說明方程可靠性較高。CV值越低，顯示實驗穩(wěn)定性越好，本實驗中CV值分別為3.73%和4.30%，較低，說明實驗操作可信度高。綜上說明了該回歸方程為優(yōu)化勻漿提取白扦中莽草酸的工藝條件提供了一個良好的模型。

表3 回歸方程可信度分析Table 3 Reliabilityanalysis ofregression equation

表4 回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis result

采用Design Expert 7.0程序?qū)嶒灲Y(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表4。表4中的Pr＞F值項表示大于F值的概率，從中可以看出收率X1、X3對Y值的影響顯著 (Pr＞F的值小于 0.05)對Y值的影響高度顯著(Pr＞F的值小于0.005)；純度X2對P值的影響顯著 (Pr＞F的值小于 0.05)對P值的影響高度顯著(Pr＞F的值小于0.005)，表明實驗因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，因子間交互作用項的影響相對較小。

應(yīng)用design expert 7.0中Box-Behnken中Optimization Choises的Numerical Optimization對莽草酸的收率與純度進(jìn)行最優(yōu)化(maximize)設(shè)計。得到在同一提取條件下，莽草酸的收率及純度最佳的提取工藝條件：

提取溫度為40.44℃，提取時間為3.02min，提取料液比為1:10.29，莽草酸提取率的理論值可達(dá)0.86%，純度的理論值可達(dá)到6.28%。其合意性(desirability)為0.864。而莽草酸的收率及純度的綜合影響的合意性(desirability)，可見圖7。但考慮到實際情況將最佳提取工藝條件修正為提取溫度為40℃，提取時間為3 min，提取料液比為1∶10.3。分別取10 g白扦原料在最佳勻漿提取條件下提取，重復(fù)實驗3次取平均值，驗證實驗結(jié)果。莽草酸收率為0.84%，與收率的理論值相差0.02%；莽草酸純度為6.15%，與純度的理論值相差0.13%。

圖7 各因素對莽草酸的收率與純度的合意性的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plot of the combined effects of factors on the extraction rate and the purity

4 結(jié)論

通過對4種常用的提取方法的比較，選擇勻漿提取法作為從白扦中提取莽草酸的方法。并對勻漿提取過程中的各因素在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計法進(jìn)行了優(yōu)化，以莽草酸收率和純度為指標(biāo)，得到最佳工藝條件為：提取溫度為40℃，提取時間為3min，提取料液比為1：10.3。莽草酸的收率可達(dá)0.84%，莽草酸的純度可達(dá)6.15%。

［1］劉永友,廖曉峰.莽草酸的研究進(jìn)展［J］.化工時刊,2007,21(3):54-57.

［2］程能能,陳斌艷,王永銘.新型口服抗流感藥-奧斯他韋［J］.中國臨床藥學(xué)雜志,2002,11(1):57～59.

［3］John J,Frederick G,Peter S,et al.Efficacy and safety of the oral neuraminidase inidse inhibitor osetamivir in treating acute influenza［J］.JAMA,2002,283(8):1016～1019.

［4］John C R,Kenneth MK,Michael J P,et al.Practical total synthesis of the anti-influenza drug GS-4104［J］.J Org Chem,1998,6(3):45～46.

［5］Federspiel M,Fischer R,HennigM,et al.Industrial synthesis ofthe key precursor in the synthesis of the anti-influenza drug oseltamivir phosphate［J］.Orgprocess Res Dev,1999,43(3):266～268.

［6］Becker M W,Chapman H H,Kelly D E,et al.Manufacture of cyclohexenecarboxylate esters and intermediates［P］.WO:9955664,1999-111-14.CA1999,13(1):338～591.

［7］林海祿,彭雪嬌,羅明標(biāo),等.八角茴香中莽草酸超聲提取工藝研究［J］.食品科技,2007,5(4):76～78.

［8］李偉,曹庸.八角茴香及其提取物莽草酸的研究進(jìn)展［J］.江蘇調(diào)味副食品,2007,24(3):1～5.

［9］邊清泉,汪紅,羅英,等.HPLC測定不同植物中莽草酸的含量［J］.中國中藥雜志,2007,32(14):1485～1487.

［10］梁爾源,邵雪梅,胡玉熹,等.內(nèi)蒙古草原沙地白扦年輪生長指數(shù)的變異［J］.植物生態(tài)學(xué)報,2001,25(2):190～194.

［11］史權(quán).提取10-羥基喜樹堿和喜樹堿創(chuàng)新技術(shù)研究［D］.哈爾濱,東北林業(yè)大學(xué),2004.

［12］吳蕾,洪建輝,甘一如,等.高壓勻漿破碎釋放重組大腸桿菌提取包含體過程的研究［J］.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報,2001,15(2):191～194.

［13］祖元剛,趙春建,李春英,等.鮮法勻漿萃取煙葉中茄尼醇的研究［J］.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報,2005,19(6):757～761.

［14］趙春建,祖元剛,付玉杰,等.勻漿法提取沙棘果中總黃酮的工藝研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2006,26(2):38～40.

［15］楊磊,李家磊,趙春建,等.印楝種子中印楝素A的勻漿提取工藝［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,36(9):65～67.

［16］祖元剛.打漿萃取裝置：ZL，02275225.0［P］.2002-09-11.