Real-time PCR方法檢測(cè)肉品中的沙門氏菌

方 平，楊永莉，楊 寶，王曉聞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

在我國(guó)，沙門氏菌污染引起的食物中毒占食源性疾病中細(xì)菌食物中毒病例的70%～80%[1]，且WHO已將沙門氏菌列入具有嚴(yán)重為害和中等為害的食物傳播性病原[2]。而沙門氏菌常規(guī)檢測(cè)方法和普通PCR方法的靈敏度及檢測(cè)所需要的時(shí)間還有待于進(jìn)一步提高。

本研究用普通PCR方法檢測(cè)引物對(duì)沙門氏菌的特異性，并用SYBR Green I作為熒光染料，擬用Real-time PCR方法檢測(cè)熟制牛肉和香腸中沙門氏菌，以建立一種檢測(cè)肉品中沙門氏菌速度快、靈敏度高的方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

試驗(yàn)樣品：熟制牛肉（市售）、香腸（市售）。

試驗(yàn)菌株：沙門氏菌和非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株各10株（表1）。

SYBR Green I，dNTP，buffer，Taq 酶等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Ladder購(gòu)自天根生物（北京）有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠），Mx3000P熒光定量PCR儀（Stratagene公司，美國(guó)），Scientz-04無菌勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司），WFH-201BJ紫外可見透射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 引物的選擇與合成

本試驗(yàn)選用Wang等[3]報(bào)道的fimI基因序列中的1對(duì)引物，其序列如下。

上游引物為 5′-CCTTT CTCCA TCGTC CTGAA-3′；下游引物為5′-TGGTG TTATC TGCCT GACC-3′。這對(duì)引物可擴(kuò)增沙門氏菌fimI基因中1段大小為85 bp的序列，引物由北 京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用菌株

1.4 樣品的前處理

取過夜培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌液，按10倍梯度進(jìn)行稀釋，分別取10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10的 稀釋液1 mL于25 g無菌操作剪碎的肉沫中，同時(shí)選3個(gè)稀釋梯度的稀釋液，吸取1 mL進(jìn)行沙門氏菌的菌落記數(shù)，分別作3個(gè)平行樣品，同時(shí)作空白對(duì)照組，并用常規(guī)檢測(cè)沙門氏菌的方法檢測(cè)原肉品作對(duì)照。將已加菌液的肉沫加入225 mL的無菌生理鹽水，置于500 mL的三角瓶中，進(jìn)行無菌操作勻漿，然后分別吸取1 mL勻漿液進(jìn)行菌落記數(shù)，同時(shí)吸取1 mL用于提取DNA。將剩余的菌液置于37℃下振蕩培養(yǎng)，每隔1 h吸取1 mL勻漿液提取DNA。如此操作，每個(gè)稀釋梯度的樣品進(jìn)行6次DNA的提取試驗(yàn)。

1.5 反應(yīng)模板的制備

關(guān)于沙門氏菌DNA的制備方法有許多介紹[4]，本試驗(yàn)依據(jù)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中的經(jīng)典分子生物學(xué)細(xì)菌總DNA提取方法[5]進(jìn)行。

提取熟制牛肉中的沙門氏菌DNA的步驟如下[6-7]。（1）將沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，取細(xì)菌培養(yǎng)液1 mL于Eppendorf管中離心，棄去上清液。（2）沉淀中加入567 μL TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打沉淀，使之重新懸??；加入30 μL10%SDS和3 μL20 mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，37℃溫育1 h。（3）取上清液加等體積氯仿/異戊醇混合液（體積比為24∶1）搖勻，冰浴 10 min，14 000 r/min離心5 min。取上清液，加等體積酚/氯仿/異戊醇混合液（體積比為25∶24∶1）搖勻，冰浴10 min，14 000 r/min離心5 min，取上清液。（4）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中（約200 μL），加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇（400 μL），置于-20℃冰凍1 h或過夜。（5）14 000 r/min低溫高速離心15 min，棄去上清液，離心管倒置，風(fēng)干，用30 μLTE緩沖液溶解，于-20℃冰箱放置備用。

以牛肉中的沙門氏菌DNA的提取方法為基礎(chǔ)提取香腸中沙門氏菌DNA時(shí)，由于香腸中加入了許多淀粉、調(diào)味料等多種成分配料，使得DNA模板的提取難度增加。在1.5中（1）～（3）步驟后，如果上清液不能順利地完成，可以再重復(fù)步驟（3）的操作，同時(shí)，在步驟（3）后，再加一步丙三醇清洗來提高DNA模板的沉淀。

1.6 PCR反應(yīng)體系和參數(shù)[8]

Real-time PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μL，包括 SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.7 μL，DNA 模板 5.0 μL，ddH2O 5.6 μL。并按此順序加樣。用5 μL的ddH2O代替DNA模板作空白對(duì)照組。

Real-time PCR反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性 5 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸10 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫 1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌引物的特異性試驗(yàn)

分別吸取沙門氏菌和非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA提取液6 μL作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

2.2 食品樣品中沙門氏菌的檢測(cè)

對(duì)經(jīng)國(guó)標(biāo)（GB/T 4789.4—2003）和普通PCR方法檢測(cè)都確認(rèn)是沙門氏菌陰性的食品樣品，再用Real-time PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄擴(kuò)增曲線和熔解曲線。同時(shí)，用鼠傷寒沙門氏菌的增菌液吸取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行電泳。由圖1，2可知，引物對(duì)沙門氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶清晰明亮，沒有拖尾和非特異性帶，而對(duì)非沙門氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物無條帶，與空白對(duì)照組效果一樣。因此，引物對(duì)沙門氏菌具有較強(qiáng)的特異性。按1.4的步驟作陽性對(duì)照。

2.2.1 市售熟制牛肉中沙門氏菌的檢測(cè) 對(duì)人工加入不同稀釋度菌液的牛肉進(jìn)行平板計(jì)數(shù)及Real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3，4所示。

圖3的熔解曲線中，陽性對(duì)照為鼠傷寒沙門氏菌。從圖3可以看出，牛肉中沙門氏菌濃度從1.3×107cfu/25 g到13 cfu/25 g均呈現(xiàn)一個(gè)典型的熔解峰，并且其熔解峰與陽性對(duì)照一致，擴(kuò)增目標(biāo)基因的熔點(diǎn)值Tm為85.602℃，說明Realtime PCR方法檢出的是沙門氏菌而非其他菌株，檢測(cè)結(jié)果為沙門氏菌陽性。同時(shí)，空白對(duì)照和沙門氏菌量少到2 cfu/25 g時(shí)，均未出現(xiàn)特異性的熔解峰，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

擴(kuò)增曲線如圖4所示，曲線拐點(diǎn)清楚，標(biāo)準(zhǔn)的基線平直，無明顯的上揚(yáng)趨勢(shì)，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，擴(kuò)增比較好。由圖4可知，牛肉中沙門氏菌濃度從1.3×107cfu/25 g依次減少至13 cfu/25 g，擴(kuò)增曲線的Ct值依次增加且都小于40，而2 cfu/25 g和空白對(duì)照組的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)基線重復(fù)，即Ct值均為0，可見SYBR Green I Real-time PCR方法檢測(cè)牛肉中的沙門氏菌的檢出限為13 cfu/25 g。

由表2可知，用常規(guī)PCR方法檢測(cè)市售熟制牛肉中沙門氏菌的靈敏度為128 cfu/25 g，而用Real-time PCR方法檢測(cè)的靈敏度為13 cfu/25 g，靈敏度明顯高于常規(guī)PCR檢測(cè)方法。

表2 SYBR GreenⅠReal-time PCR與常規(guī)PCR的比較

2.2.2 市售香腸中沙門氏菌的檢測(cè) 對(duì)人工加入不同稀釋度菌液的香腸同時(shí)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)及Real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖5，6所示。

圖5的熔解曲線中，陽性對(duì)照為鼠傷寒沙門氏菌。從圖5可以看出，香腸中的沙門氏菌濃度從1.2×107cfu/25 g到12 cfu/25 g均呈現(xiàn)出一個(gè)明顯的熔解峰，并且其熔解峰與陽性對(duì)照一致，擴(kuò)增目標(biāo)基因的熔點(diǎn)值Tm為85.602℃，說明SYBR Green I Real-time PCR方法檢出的是沙門氏菌而非其他菌株，檢測(cè)結(jié)果為沙門氏菌陽性，其特異性比較強(qiáng)。同時(shí)，空白對(duì)照和鼠傷寒沙門氏菌量少到1 cfu/25 g時(shí)，均未出現(xiàn)特異性的熔解峰，說明檢測(cè)結(jié)果為陰性。

擴(kuò)增曲線（圖6）中，樣品曲線與陽性對(duì)照的曲線整體平行性較好，曲線拐點(diǎn)清楚，標(biāo)準(zhǔn)的基線平直，無上揚(yáng)趨勢(shì)，說明各反應(yīng)管的平等性好，擴(kuò)增效果比較好。由圖6可知，香腸中的鼠傷寒沙門氏菌濃度從1.2×107cfu/25 g依次減少至12 cfu/25 g，擴(kuò)增曲線的Ct值逐漸增加且都小于40，而1 cfu/25 g和空白對(duì)照組的Ct值均為0，所以SYBR Green I Real-time PCR方法檢測(cè)香腸中的沙門氏菌的檢出限為12 cfu/25 g。

從表3可以看出，用常規(guī)PCR方法檢測(cè)市售香腸中沙門氏菌的靈敏度為116 cfu/25 g，而用Real-time PCR方法檢測(cè)市售香腸中沙門氏菌的靈敏度為12 cfu/25 g，靈敏度明顯高于常規(guī)PCR檢測(cè)方法。

表3 SYBR Green I Real-time PCR與常規(guī)PCR的比較

2.3 可重復(fù)性試驗(yàn)

為驗(yàn)證Real-time PCR方法的可重復(fù)性，以同一濃度的鼠傷寒沙門氏菌DNA為模板，做3個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行同條件的擴(kuò)增。結(jié)果（圖7）顯示，3個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線基本吻合，3次擴(kuò)增曲線的 Ct值分別為 28.56，28.39，28.41。經(jīng)計(jì)算，3 次擴(kuò)增曲線Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差為0.093，變異系數(shù)CV（coefficient of variation）為0.33%。而一般熒光PCR儀的Ct值重復(fù)性誤差在CV≤2.1%范圍內(nèi)就可以[9]，可見，本試驗(yàn)所研究的Real-time PCR方法具有較高的可重復(fù)性，從而保證了不同樣品間檢測(cè)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

2.4 抗干擾性試驗(yàn)

在食品樣品中接種少量的鼠傷寒沙門氏菌菌液，再分別接種大腸埃希氏菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌等（接種量大于沙門氏菌），另外，作一組只接種相同量的沙門氏菌樣品為對(duì)照，用Real-time PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)試驗(yàn)，接種雜菌的待檢樣品中的沙門氏菌含量達(dá)到Real-time PCR方法的檢測(cè)靈敏度，因此，該方法不受其他雜菌的影響。

3 討論

Real-time PCR方法在普通PCR基礎(chǔ)上，增加了SYBR Green I熒光染料，在PCR擴(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，可大大提高檢測(cè)的靈敏度。Real-time PCR方法采用完全封閉的管和熒光染料同步檢測(cè)，省略了PCR產(chǎn)物的電泳和紫外燈下觀測(cè)等步驟，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過程，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。Real-time PCR方法還比較安全，整個(gè)體系中不包含EB等有毒物質(zhì)，對(duì)環(huán)境的污染和人體的危害很小。本試驗(yàn)建立了針對(duì)沙門氏菌的Realtime PCR檢測(cè)方法，其檢測(cè)時(shí)間（不包括增菌和前處理）僅需1.5 h。因此，該檢測(cè)方法快速、靈敏、穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便，易于掌握[10-11]。

Real-time PCR具有上述諸多優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也存在一些不足之處。如Real-time PCR方法運(yùn)用了封閉的檢測(cè)，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測(cè)步驟，因此也就不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小[12]（本試驗(yàn)先用普通PCR檢測(cè)，知道其擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，再用Real-time PCR方法提高其檢測(cè)的靈敏度，避免了這一不足之處）；熒光PCR儀價(jià)格較昂貴，從而限制了其廣泛的應(yīng)用；熒光染料見光易分解，需要避光保存等。另外，它的特異性完全依賴于引物，并不比常規(guī)的PCR具有更高的特異性；熒光信號(hào)的強(qiáng)弱依賴于雙鏈DNA的質(zhì)量而不是分子數(shù)[13]。在擴(kuò)增效率相同的情況下，長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的信號(hào)要強(qiáng)于短擴(kuò)增產(chǎn)物。如果擴(kuò)增效率不同，那么定量會(huì)更不準(zhǔn)確。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，尤其是對(duì)于檢測(cè)工作來說，熒光PCR技術(shù)將越來越得到廣泛的應(yīng)用，成為病原菌檢測(cè)的主要技術(shù)之一。

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