優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取葎草總黃酮的工藝研究

董江濤，李 燕，蔣橙華，徐慧強

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

葎草（Humulus scandens（Lour）Merr）又名烏爪龍、拉拉藤、過膚龍等，為?？迫劜輰俨荼局参颷1]，野生于路旁、田邊、林地、草地、果園等處，通常群生，生命力強，廣泛分布于我國大部分地區(qū)[2]。由于其盤繞植株蔓延，且生長迅速，影響農(nóng)作物的生長，被視為害草而未被重用。它具有清熱解毒、消腫、利尿功效，有抗革蘭氏陽性細菌的作用；而且營養(yǎng)豐富，可作蔬菜、飼料[3]?，F(xiàn)代藥理研究證明，葎草具有抗菌、抗炎、止瀉[4]、抑菌、降壓、鎮(zhèn)痛等作用。已有報道表明，從葎草全草中分離出的主成分為黃酮類化合物[5]。但是，葎草黃酮的提取鮮有報道，并且提取得率差別很大。本研究期望通過響應(yīng)曲面法的優(yōu)化，在獲得較高提取得率的同時，測定出葎草中黃酮的含量。

微波提取具有高效、節(jié)能、快速、提取率高的優(yōu)點，但微波容易造成溶液受熱不均。而超聲波振動的空化效應(yīng)使得樣品介質(zhì)各點受熱一致[6]，并且不破壞物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，則超聲-微波聯(lián)合提取，發(fā)揮了二者優(yōu)點的同時又彌補了各自的不足，從而提高了活性物質(zhì)的提取得率[7]。

本試驗以黃酮的提取得率為指標，對各主要影響因子——微波功率、超聲功率和超聲時間/間隔時間的單一和交互作用等進行較深入的研究，應(yīng)用響應(yīng)曲面法對微波提取葎草黃酮的條件進行優(yōu)化，得出微波輔助提取的最佳工藝參數(shù)，為以后的研究提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

葎草，11月中旬采自安徽亳州，自然晾干；蘆丁標準品，由中國藥品生物制品檢定所提供；無水乙醇，NaNO2，Al（NO3）3，NaOH均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ-UV2000紫外可見分光光度計（尤尼柯儀器有限公司）；XH-300A祥鵠電腦微波-超聲波組合合成萃取儀（北京祥鵠高科技發(fā)展有限公司）；sartorius BS210S電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；多功能粉碎機（廣東佛山市方勝電器有限公司）；H2050R-1高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；微量移液槍（德國eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 制備提取液 取已干燥的葎草粉碎，過0.84 mm篩，準確稱取1.0 g，加入60%乙醇，超聲-微波協(xié)同輔助提取。提取液經(jīng)抽濾、離心后于50 mL容量瓶中用60%乙醇定容，搖勻待用。1.3.2 制作蘆丁標準曲線 準確稱取0.010 0 g蘆丁標準品放入小燒杯中，加60%的乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，搖勻，得到0.200 mg/mL的蘆丁標準液。分別移取 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL的蘆丁標準液于8個25 mL容量瓶中，各加1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min。再各加1.0 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置6 min。繼續(xù)各加入10 mL 4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀釋到刻度，靜置15 min。在波長510 nm處測定吸光度（A），以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，A為縱坐標作標準曲線[8]。

1.3.3 總黃酮含量測定與計算 黃酮含量測定采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法，其原理是先用亞硝酸鈉還原黃酮，再加硝酸鋁絡(luò)合生成穩(wěn)定的紅橙色化合物，于510 nm（符合定量分析的比爾定律）波長處測定吸光值，通過標準曲線計算黃酮含量。

準確移取1.0 mL的樣品液于50 mL容量瓶中，加1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；再加1.0 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置6 min；最后加入10 mL4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀釋到刻度，靜置15 min。在510 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線換算，按以下公式計算總黃酮得率。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計 分別考察了微波功率、超聲波功率和提取時間3個因素在各自5個水平上的提取得率，及超聲時間/間隔時間在1/2，2/1，1/0水平上的提取得率。具體參數(shù)列于表1。

表1 單因素試驗考察因素及水平

1.3.4.1 微波功率對提取得率的影響 在液料比20∶1、乙醇濃度60%、提取時間20 min、超聲功率為600 W、超聲時間/間隔時間為1/0的條件下，考察微波功率對葎草黃酮提取得率的影響。

1.3.4.2 超聲波功率對提取得率的影響 在液料比20∶1、乙醇濃度60%、微波功率420 W、提取時間20 min、超聲時間/間隔時間1/0的條件下，考察超聲波功率對葎草黃酮提取得率的影響。

1.3.4.3 提取時間對提取得率的影響 在液料比20∶1、乙醇濃度60%、微波功率420 W、超聲功率為600 W、超聲時間/間隔時間1/0的條件下，考察提取時間對葎草黃酮提取得率的影響。

1.3.4.4 超聲時間/間隔時間對提取得率的影響

在液料比20∶1、乙醇濃度60%、微波功率為420 W、超聲功率為600 W、提取時間為20 min的條件下，考察超聲時間/間隔時間對葎草黃酮提取得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)曲面設(shè)計 在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，綜合考慮超聲功率、微波功率和超聲時間/間隔時間3個因素對葎草總黃酮提取得率的影響，采用Box-Behnken設(shè)計方案做響應(yīng)曲面研究，建立了葎草黃酮提取得率的二次多項式數(shù)學模型。3個自變量超聲功率、微波功率和超聲時間 /間隔時間分別以 X1，X2和 X3代表，以 +1，0，-1分別代表各自的不同水平。編碼因素及水平、試驗設(shè)計方案如表2所示。

表2 響應(yīng)面法分析因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

從圖1可以看出，蘆丁標準曲線回歸方程為：A=9.412 2C－0.005 4（R2=0.999 7），其中，C 為黃酮濃度（mg/mL），A為吸光度，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 微波功率對提取得率的影響 由圖2可知，在較低的微波功率條件下，黃酮的提取得率隨微波功率的增強而顯著增加，但微波功率大于420 W后，黃酮提取得率會降低，這是因為過高的微波功率會促使黃酮類物質(zhì)氧化，使得總黃酮的提取得率降低。

2.2.2 超聲波功率對提取得率的影響 由圖3可知，在400～600 W的超聲波功率條件下，黃酮的提取得率隨超聲波功率的增強而顯著增加，超聲波功率達到600 W時達到極大值，是由于超聲的“空化效應(yīng)”和“機械效應(yīng)”使細胞結(jié)構(gòu)破壞，黃酮類物質(zhì)易溶出；之后黃酮提取得率隨超聲功率的增加而降低，這或許是因為較高的超聲功率破壞了黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

2.2.3 提取時間對提取得率的影響 由圖4可知，在5～20 min內(nèi)，隨著提取時間的延長，總黃酮得率呈直線上升，在20 min時，黃酮提取得率達到最大值，之后開始下降。其原因是浸提開始時，葎草與溶劑接觸充分，黃酮能夠充分溶解，但隨著時間的延長，會有部分黃酮類物質(zhì)被氧化以及結(jié)構(gòu)遭到破壞，使得黃酮提取得率降低，因此，選擇20 min為葎草黃酮提取的較佳時間。

2.2.4 超聲時間/間隔時間對提取得率的影響由圖5可知，黃酮提取得率隨著超聲時間/間隔時間的增大而增加，當連續(xù)超聲時間達到極大值時，說明連續(xù)超聲的作用大于間歇性的作用。這是因為連續(xù)的超聲作用使黃酮類物質(zhì)的溶解呈持續(xù)增加的現(xiàn)象，因此選擇連續(xù)超聲提取。

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗 響應(yīng)曲面設(shè)計試驗中，以超聲波功率、微波功率、超聲時間/間隔時間為參數(shù)，葎草黃酮的提取得率為響應(yīng)值，進行了3因素3水平響應(yīng)曲面分析試驗（表3）。

由表3可知，試驗值與預(yù)測值很接近，模型適應(yīng)性高。利用Design Expert 7.0.0軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到葎草黃酮提取得率（Y）對編碼自變量超聲功率（X1）、微波功率（X2）和超聲時間/間隔時間（X3）之間的二次多項回歸方程：

模型的回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗列于表4。

表3 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果

表4 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗

從表4黃酮得率回歸模型方差分析可以看出，F(xiàn)回=49.33＞F0.01（9.4）=14.8，P＜0.000 1，表明模型顯著。黃酮得率F失擬=0.50＜F0.05（9.3）=8.81，失擬項P=0.70＞0.05，表明失擬不顯著。模型一次項超聲功率X1（P=0.000 3）、微波功率X2（P=0.001 2）、超聲時間/間隔時間X3（P=0.006 4）顯著；二次項均顯著；交互項：超聲功率與微波功率X1X2（P=0.005 8）、超聲功率與超聲時間/間隔時間X1X3（P=0.001 2）顯著，微波功率與超聲時間/間隔時間X2X3（P=0.271 8）不顯著。

用Design Expert軟件中Box-Behnken法計算葎草黃酮得率回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)（Ad-jR-squared）=0.964 5， 即該模型能解釋96.45%響應(yīng)值的變化，模型擬合程度良好，試驗誤差小，說明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取條件提取葎草總黃酮是可行的。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析 利用Design Expert 7.0.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到的二次回歸方程的等高線及其響應(yīng)面如圖6～8所示。通過二次模型所得到的等高線及響應(yīng)曲面形狀來判斷試驗因素之間的交互作用強度，以及確定各因素的最佳水平范圍。

由圖6可知，當提取時間、超聲時間/間隔時間固定、超聲功率不變的條件下，微波功率在400～420 W范圍內(nèi)增大時，曲線較陡，葎草黃酮提取得率急劇增加，在420 W附近達到極大值而后緩慢降低，曲率變化明顯，與單因素試驗結(jié)果相吻合。

由圖7可知，微波功率、超聲時間/間隔時間不變的條件下，固定提取時間，曲線呈現(xiàn)陡峭增加，曲率變化明顯，達到極大值后呈現(xiàn)平滑遞減的規(guī)律，說明超聲功率在較低的水平下對葎草黃酮提取得率影響大于較高水平下的影響。

由圖8可知，微波功率、提取時間不變的條件下，固定提取時間和超聲功率，葎草黃酮提取得率隨著超聲時間/間隔時間的升高先增加后降低，在1/0時達到極大值，說明連續(xù)超聲的作用大于間斷性的超聲作用，呈較陡的曲線。

響應(yīng)曲面坡度可反映響應(yīng)值對因素變化的敏感性，等高線的形狀可反映交互作用的強弱[9-10]。從圖6～8可以看出，響應(yīng)面陡峭，說明提取得率對微波功率、超聲波功率和超聲時間/間隔時間的變化敏感；等高線呈橢圓，說明超聲功率和超聲時間/間隔時間、超聲功率和微波功率之間交互影響顯著。

對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即3個主要因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為：微波功率424.590 W、超聲功率624.000 W、超聲時間/間隔時間1/0，此條件下葎草總黃酮的得率達1.899%，得率較高。

2.4 模型驗證

對試驗進行驗證，選擇的條件為：超聲功率620 W、微波功率420 W、超聲時間/間隔時間1/0、提取時間20 min、液料比20∶1，黃酮的得率分別為 1.78%，1.83%，1.85%，1.80%，1.83%，重復性較好，平均為1.82%，偏差不大，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好。吸光度測量值穩(wěn)定，說明每次的提取液中黃酮含量比較接近，證明該結(jié)果是合理可靠的。

3 結(jié)論

為了比較響應(yīng)曲面法相對正交優(yōu)化的優(yōu)勢，將響應(yīng)曲面法用于分析優(yōu)化葎草總黃酮的提取條件，經(jīng)優(yōu)化后的葎草總黃酮得率可保持在1.8%以上的水平，說明響應(yīng)曲面法能更好地反應(yīng)各因素之間的相互作用，是一種比較好的優(yōu)化工藝的方法。

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