鱈魚皮水解蛋白亞鐵修飾產(chǎn)物(Fe-FPH)結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)分析

吳衛(wèi)平，鄧尚貴，徐 濤，滿德慧，唐 艷，黃 薇，沈璐璐

(1.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江舟山 316101；2.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)院，浙江舟山 316000)

鱈魚Gadous macrocephaius，大型冷水性重要經(jīng)濟魚，名貴食用魚，全球鱈魚年捕獲量達1 000萬t，約占海洋漁業(yè)總產(chǎn)量的12%。鱈魚產(chǎn)品有冷凍魚片、魚段、塊凍魚排等，加工過程中產(chǎn)生大量的下腳料，其中僅去除的魚皮量約占原料的10%。目前，下腳料酶解利用[1-13]被各國廣泛研究，但主要用于生產(chǎn)動物飼料，附加產(chǎn)值不高。蛋白鐵肽[14]是以水解蛋白和蛋白質(zhì)多肽吸收理論為基礎(chǔ)研發(fā)的一種全新功能性食品，產(chǎn)品不僅實現(xiàn)了邊角料高附加值利用的產(chǎn)業(yè)化問題而且針對人體營養(yǎng)學(xué)需要，利用螯合技術(shù)，蛋白鐵肽中鐵元素易于被人體吸收且釋放過程能得到有效控制，在滿足人體氨基酸需求的同時滿足人體對鐵的需要，可謂一舉多得。本文對鱈魚皮制取蛋白鐵肽進行了研究，并對Fe-FPH進行了營養(yǎng)、結(jié)構(gòu)和食品安全分析。

1 材料與方法

1.1 酶

木瓜蛋白酶(2 000 000 IU/g)，食品級，廣西南寧龐博生物工程有限公司出品；風味酶(400 000 IU/g)，食品級，廣西南寧龐博生物工程有限公司出品。2種酶復(fù)合后的最適宜水解條件為pH 6.5,45℃，復(fù)合比為1:1料液比為1:2，水解時間為4.5 h。復(fù)合酶失活條件為90℃、20 min。

1.2 原材料

鱈魚皮(注意避免脂肪氧化)，浙江海力生生物科技有限公司提供。原料清洗干凈后分為兩部分,一部分作為不脫脂的原料(FM，脂肪含量42.8 g/kg)，搗碎勻漿后貯藏于-18℃?zhèn)溆?；另一部分?jīng)過1 g/kg NaHCO3、1 g/kg NaCl和蒸餾水脫脂、搗碎和勻漿后貯藏于-18℃作為脫脂原料(DM，脂肪含量6.2 g/kg)備用。進行酶水解前，將原料取出并貯放于-4℃的冰箱中過夜。

1.3 工藝流程

1.4 螯合水解液的制備

原料加2倍體積的蒸餾水混勻，混合物的pH約為6.5。螯合水解液制備參照復(fù)合酶法[15]，僅將復(fù)合比改為1:1。水解完成后，將混合液的溫度升高到90℃并保持20 min滅酶，冷卻至室溫，用100目尼龍布過濾去掉未水解組分，然后8000 r/min條件下離心15 min去掉沉淀組分，然后采用截留分子量為6 ku的超濾膜進行超濾分離，收集超濾液并貯放于4℃條件備用。

1.5 螯合物的制備

在不斷攪拌、不同的溫度、不同的時間等條件下，向超濾液中連續(xù)加入1 mol/L FeCl2進行螯合修飾。通過雙效濃縮,蒸發(fā)量1 000 kg/h，蒸汽壓0.09 MPa，蒸發(fā)溫度70℃，真空度-0.06 MPa，使總固型物達到30%；然后進行瞬時殺菌，殺菌溫度130℃，蒸汽壓力0.6 MPa，殺菌時間4 ～6 s，出料溫度50 ～60℃；最后通過噴霧干燥得到樣品，工藝為進料溫度50 ～60℃，進風溫度205℃，出風溫度90 ～95℃。

1.6 分析方法

1.6.1 蛋白質(zhì)水解度(DH)的測定

公式中h是已斷裂的肽鍵數(shù)目，ht是原料蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中總的肽鍵數(shù)目，A是水解物中總氨基氮數(shù)量(mg/g蛋白質(zhì))，B是水解物中游離氨基氮數(shù)量，C是原料的游離氨基氮數(shù)量。B和C的具體數(shù)值可用電位滴定法測定。方法如下：

A 10 mL水解物轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶用蒸餾水稀釋，然后取20 mL稀釋后溶液于200 mL燒杯，加60 mL蒸餾水，用0.05 mol/L NaOH邊攪拌邊滴定調(diào)節(jié)pH到8.2，再加入10.0 mL中性甲醛溶液，用0.05 mo1/L氫氧化鈉標準溶液滴定至pH 9.2的體積(mL)。

式中：V1為樣品稀釋再加入甲醛后滴定至終點(pH 9.2)所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL)；V2為空白試驗加入甲醛后滴定至終點(pH 9.2)所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL)；M為氫氧化鈉標準溶液濃度(mol/L)；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmol)；m為測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量(g)。

C用如上方法，僅用10.0 mL未水解物替換原水解物測定。

1.6.2 螯合率的測定

準確稱取0.497 g FeSO4·7H2O，溶于100 mL蒸餾水中，加5 mL濃硫酸，微熱，溶解后隨即加入2%的高錳酸鉀溶液至最后一滴紅色褪去為止。用水稀釋至1 000 mL，搖勻，得到標準溶液，此溶液每mL含100 μg鐵。取10 mL此溶液于100 mL容量瓶加蒸餾水至刻度，搖勻，所得溶液每毫升含10 μg鐵含鐵分別吸取該溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置于 50 mL 比色管。加 1 mL 1 mol/L 的 HCl，1 mL 10%的鹽酸羥胺溶液，1 mL 0.12%的鄰菲羅啉溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，再加5 mL 10%的醋酸鈉溶液。用水稀釋至刻度，搖勻，以空白做參比，于510 nm波長測吸光值，并作標準曲線。

每mL水解液實際鐵添加量記作A，水解液經(jīng)無水乙醇沉淀灰化處理后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，吸取5 mL溶液于比色管，測吸光值，參照吸光值計算Fe含量，結(jié)果為鰲合鐵含量B。螯合率(CR)為：CR=B/A×100%，公式中A(g/kg)為樣品中鐵的總含量，B(g/kg)為樣品中螯合鐵的含量。

1.6.3 紅外光譜測定

取樣品2 mg放入瑪瑙研缽中，放入干燥的光譜純KBr 200 mg,混合研磨均勻(在紅外燈下進行)，使其粒度在2.5 μm以下，裝入壓片模具，抽氣加壓，壓力約為60 MPa，維持3 ～5 min，卸掉壓力則可得一透明的KBr樣品片，利用島津IR 435紅外分光光度計進行定性分析，得到光譜。

1.6.4 氨基酸分析方法[20]

1)樣品不經(jīng)水解進行基本氨基酸分析;

2)樣品分別經(jīng)6 mol/L HCl和4.2 mol/L NaOH水解，然后進行基本氨基酸分析，儀器為日立835-50型高速氨基酸分析儀。

2 結(jié)果與討論

圖1 DH與水解時間(X)關(guān)系Fig.1 Relationship between hydrolysis time and DH for different raw materials

2.1 原料脂肪含量對水解的影響

對于FM而言，其水解曲線包括了大量肽鍵被快速斷裂的初始階段(1 ～10 h)和僅有少部分肽鍵被切斷的第二階段(10 ～20 h)，這種變化規(guī)律與沙丁魚[21]、小龍蝦[22]、鯡[23]和鮭[24]蛋白的酶水解曲線相似，并且在水解時間超過2 h后的水解過程中，其水解度顯著高于DM(圖1)。對于DM而言，其DH與水解時間的關(guān)系曲線呈現(xiàn)出典型的線性關(guān)系。2種原料在水解時存在的顯著差異主要是因為脫脂處理也除去了DM的可溶性蛋白和內(nèi)源酶。

2.2 最優(yōu)條件確定

2.2.1 DH的確定

如圖2所示，無論是FM還是DM在蛋白質(zhì)水解度為5%時能達到最大螯合率。結(jié)果表明螯合所需要的蛋白質(zhì)水解度為5%，此時的蛋白質(zhì)水解物能夠提供足夠的配位數(shù)。

2.2.2 螯合pH的確定

如圖3所示，無論是FM還是DM其螯合率在pH 4.0 ～7.0的范圍內(nèi)都隨著pH的升高而迅速增加，當pH超過7.0時，螯合率迅速降低。在pH 4.0 ～7.0的范圍內(nèi)螯合率的迅速增加主要是因為水解物的-NH2和-COOH的配位能力得到增強，但當pH超過7.0時，F(xiàn)e2+更容易與反應(yīng)體系中的OH－結(jié)合而形成Fe(OH)2，阻礙了Fe2+與-NH2和-COOH結(jié)合形成螯合物。因此，螯合反應(yīng)適宜的pH應(yīng)選擇為7.0。

圖2 不同處理樣品水解度與螯合率的關(guān)系Fig.2 Relationship between different DH and CR for different raw materials

圖3 螯合率與pH的關(guān)系Fig.3 Relationship between different pH and CR for different raw materials

2.2.3 螯合溫度與螯合時間的確定

如圖4和5所示，在溫度為10 ～50℃、螯合時間為15 ～90 min范圍內(nèi),螯合率沒有明顯的差異。表明螯合溫度與螯合時間對螯合效果沒有明顯的影響。因此，本研究選擇螯合溫度為20℃、螯合時間為15 min。

圖4 溫度對螯合率的影響Fig.4 Relationship between different temperature and CR for different raw materials

圖5 螯合時間對螯合率的影響Fig.5 Relationship between different time and CR for different raw materials

2.3 螯合物的結(jié)構(gòu)分析

如圖6所示，活性肽與其鰲合物吸收峰相比，在強弱和位置上有明顯的變化，樣品在3 130 ～3 030 cm-1銨峰消失，而在1 100 cm-1左右出現(xiàn)了(PtNH2)吸收峰，證明Fe2+與NH2有較強結(jié)合；羧基離子反對稱振動(γascoo-)于1 650 cm-1附近，羧基離子的對稱振動(γascoo-)于1 400 cm-1附近，這兩處均有較強吸收峰。反對稱振動(γascoo-)是判斷-COO-鍵共價程度的量度，而反對稱振動與對稱振動的差值γ△υ，是羧基離子與金屬離了配位方式的有力判據(jù)。樣品△υ均在250 cm-1左右，推測亞鐵離了與羧基是以單齒共價鍵的方式結(jié)合如圖7。

圖6 活性肽(左)與蛋白鐵肽(右)紅外光譜比較Fig.6 Infra-red spectrum of FPH(L)and Fe-FPH(R)

圖7 螯合物結(jié)構(gòu)Fig.7 Structure of the Fe-FPH

2.4 氨基酸組成分析

經(jīng)檢測，樣品主要以肽鏈形式存在，游離氨基酸總量占樣品的2.595%游離氨基酸種類有蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸8種，其中胱氨酸含量為1.054 g/100 g。水解后基本氨基酸組成及含量見表2。表3數(shù)據(jù)顯示鱈魚皮水解制品的氨基酸價達到理想氨基酸價的59.62%，鑒于原材料為魚品加工下腳料，因此實現(xiàn)了變廢為寶的目的。

2.5 食品安全分析

蛋白鐵肽送浙江省海洋水產(chǎn)品質(zhì)量中心檢測，檢測結(jié)果表明：產(chǎn)品符合食品安全要求，無致病菌檢出，重金屬等物質(zhì)低于國家限量標準。另有研究表明蛋白肽有較強的抑菌效果，機制可能是螯合物的肽分子與細菌細胞膜受體蛋白結(jié)合，改變細胞質(zhì)膜通透性，造成膜結(jié)構(gòu)破壞，引起膜內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，從而導(dǎo)致細菌死亡。

表1 蛋白鐵肽氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of the Fe-FPH

表2 蛋白鐵肽產(chǎn)品氨基酸價分析Tab.2 Acid value analysis of the Fe-FPH

3 結(jié)論

低值魚蛋白質(zhì)復(fù)合酶水解曲線可表達為DH=5.388 4 ln(X)+2.636 2 (R=0.992 3，未脫脂)和DH=0.815 7(X)+1.086 4(R=0.993 3,脫脂 )。鐵與酶水解物的螯合最適宜條件分別為DH 5%、pH 7.0、溫度20℃和螯合時間15 min。樣品通過紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品螯合穩(wěn)定。樣品基于機體可整體吸收肽分子的理論，根據(jù)結(jié)合于水解產(chǎn)物上的亞鐵進入機體后具有緩慢釋放的特性，以鱈魚皮水解物為鐵載體制取蛋白鐵肽，克服了傳統(tǒng)鐵強化產(chǎn)品亞鐵不穩(wěn)定以及改變產(chǎn)品色澤的缺陷；還有效避免機體局部或某時間鐵含量過高造成的不利影響，同時解決了水解產(chǎn)物的脫腥難題，經(jīng)如上工藝獲得的鱈魚皮蛋白鐵肽添加劑粗蛋白含量為85.1%，含鐵40 254 mg/kg，氨基酸價為59.62，產(chǎn)品無危害致病菌，不僅達到了補鐵要求，而且可作為營養(yǎng)品服用。不同調(diào)和配方的同類型產(chǎn)品如：魚蛋白鐵肽膠囊、魚蛋白鐵肽片劑、魚蛋白鐵肽沖劑等，大大拓展了產(chǎn)品的市場適應(yīng)范圍和人群適應(yīng)范圍。因此，產(chǎn)品研發(fā)成功不僅獲得了一種優(yōu)質(zhì)保健產(chǎn)品，而且項目的大范圍推廣還可解決廢料再利用和高值化問題，應(yīng)用范圍和經(jīng)濟效益前景頗為可觀。

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