降低烘烤花生致敏性的蛋白酶篩選

叢艷君， 薛文通

(1.北京工商大學 化學與環(huán)境工程學院， 北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院， 北京 100083)

1986年葉世泰等在我國常用食品致喘40例分析中指出，花生等油料作物位居食物過敏原的前列[1]. 流行病學研究顯示，約有3%的過敏反應由食物誘發(fā)，危及生命的過敏反應中有1/5是由花生引起[2]. 隨著全球化進程，食品的生產(chǎn)、流通和消費方式呈現(xiàn)國際化，花生過敏將成為各國共同關注的問題. 我們前期研究工作表明：Ara h1和Ara h3系列蛋白為花生主要過敏原[3]. 探索花生脫敏方法對于保障消費者安全和指導企業(yè)開發(fā)低過敏食品均具有重要的意義.

致敏蛋白質(zhì)與過敏反應相關的僅為其部分抗原決定基(數(shù)個至數(shù)十個氨基酸組成) ,因此掩蓋、破壞和去除此類基團、使引起過敏的抗原決定基不再為免疫系統(tǒng)識別是開發(fā)低過敏性花生蛋白的關鍵[4]. 酶技術以其高效、反應溫和、可控等優(yōu)點廣泛地應用于植物蛋白修飾中. 國內(nèi)用于蛋白質(zhì)水解研究的酶大多是微生物蛋白酶，對動植物蛋白酶的使用相對較少. 本研究的目的是降低烘烤花生蛋白的致敏性，即破壞花生過敏原的抗原決定簇，著眼于實際生產(chǎn)，在酶系的選擇過程中以工業(yè)化生產(chǎn)的食品級酶類為主，探索單酶水解或多酶順序水解對花生致敏性的影響，篩選降低烘烤花生致敏性的最佳用酶.

1 材料與方法

1.1 材料

花生購于北京市種子公司；堿性蛋白酶Alcalase，復合蛋白酶Protamex，固體木瓜蛋白酶Papain(S)，中性蛋白酶Neutrase，風味蛋白酶Flavorzyme，胃蛋白酶Pepsin，Protease M均購自丹麥諾維信公司；花生過敏患者血清由北京大學第三醫(yī)院友情提供.

1.2 儀器設備

BIO-RAD550型酶標儀， IO-RAD公司；HZS-H型水浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；PSH500A型生化培養(yǎng)箱，中國重慶銀河實驗儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1烘烤花生的制備及花生蛋白的提取[5]

以花育品種為試材，實驗室自制花生制品. 170 ℃烘烤20 min制備烘烤花生.

花生仁用磨粉機磨成粉，按10 mL/g比例加入正己烷，于4 ℃振蕩過夜脫脂，然后4 ℃離心10 min(12 000 g)，取沉淀風干得脫脂花生粉.

脫脂花生粉，按m/v為1∶20比例加入20 mmol/L磷酸緩沖溶液(1 mol/L氯化鈉，pH 7.8)，4 ℃振蕩提取4 h，，然后于4 ℃離心(14 000×g，10 min)，取上清液，4 ℃透析48 h之后凍藏備用.

1.3.2酶活力的測定

采用福林-酚試劑法[6]. 首先繪制酪氨酸標準曲線；然后測定蛋白酶活力，即以酪蛋白為底物，加入適當稀釋的酶液,再加入碳酸鈉溶液和稀釋的福林-酚試劑，保溫顯色20 min后，在660 nm波長下測定吸光度值，對照標準曲線，計算酪氨酸含量.

1.3.3蛋白質(zhì)水解度的測定[7]

蛋白質(zhì)水解度(Degree of hydrolysis, DH)的計算公式如下.

DH=(氨態(tài)氮/總氮)×100%

總氮測定采用凱式定氮法, 氨態(tài)氮的測定采用甲醛滴定法

1.3.4單酶水解

參照廠家提供的蛋白酶最適反應條件，選定底物濃度為5%，充分攪拌后，用恒溫水浴箱保持恒溫，加入蛋白酶. 水解過程中，不斷攪拌并加入0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值保持基本恒定，水解后取樣，所取樣品迅速煮沸3 min使酶失活，冷凍干燥后備用. 各種蛋白酶對花生蛋白的水解條件見表1，在所選蛋白酶的最適條件下，底物質(zhì)量濃度為0.05 g/mL，E：S為3 000 U/g蛋白質(zhì)，水解時間為8 h.

表1 各種蛋白酶對花生蛋白的水解條件Tab.1 The hydrolysis conditions of each emzyme to peanut protein

1.3.5雙酶分步水解

在單酶水解結(jié)果的基礎上，選用能降低烘烤花生致敏性的蛋白酶兩兩組合，先將花生蛋白溶液調(diào)至第一種酶的水解條件，水解5 h后，調(diào)至第二種酶的水解條件，加入第二種酶，3 h后取樣(共水解8 h). 把所取樣品迅速煮沸3 min使酶失活，冷凍干燥后備用.

1.3.6SDS-PAGE[8]

花生蛋白水解物用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析，所用條件為分離膠濃度12.5%，濃縮膠濃度4.5%，膠聯(lián)度3.6%，進行垂直電泳，單板恒流10 mA，樣品溶液先與等體積上樣緩沖液混合，沸水浴加熱5 min后，花生蛋白提取液5 μL(提取液質(zhì)量濃度為1 g/L)上樣；電泳后的分離膠用考馬斯亮藍R-250染色顯現(xiàn)蛋白帶，以低分子量蛋白做標準.

1.3.7酶聯(lián)免疫實驗

采用間接酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定花生蛋白酶解液致敏性強弱[9].

用包被液(50 mmol/L pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液)將花生蛋白稀釋成10 μg/mL濃度，每個樣品做三個平行；將收集的花生患者血清(一抗)和辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgE(二抗)用封閉液稀釋，然后顯色反應，終止后在450 nm波長下讀取OD值. 以TBS-Tween孔為對照，以吸光度值反應致敏性的變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶水解結(jié)果

除風味蛋白酶(Flavorzyme)外，其它的蛋白酶水解到一定時間，水解度隨時間變化曲線趨于平緩，見圖1. Alcalase、Protamex、Neutrase和Protease M 4種微生物蛋白酶活性較高，水解到7個h水解度才保持恒定，而木瓜蛋白酶(Papain S)水解到2 h后水解度就開始呈下降趨勢，胃蛋白酶(Pepsin)在整個酶解過程中水解度都較低. 7種蛋白酶中，風味蛋白酶水解程度最深，8 h水解度為8.9%，Alcalase蛋白酶次之為7.4%.

蛋白致敏性越低， OD值越低. 7種蛋白酶在各自實驗室最優(yōu)酶解條件下，致敏性變化情況見圖2. 由圖2可見，胃蛋白酶的水解物致敏性最高，木瓜蛋白酶水解物致敏性也較高，4種微生物蛋白酶水解物IgE結(jié)合能力較低，其中Alcalase蛋白酶致敏性最低，另外風味蛋白酶水解物致敏性也較低. 方差分析表明，不同蛋白酶水解花生蛋白致敏性差異顯著(p<0.05).

Alcalase活性較高，水解8個小時，花生蛋白致敏性降低了34.5%，風味蛋白酶活性也較高，水解8小時，花生致敏性降低了32.1%.

圖1 花生蛋白酶水解過程中水解度的變化Fig.1 DH of peanut protein during hydrolysis

圖2 花生蛋白酶水解過程中致敏性的變化Fig.2 Allergenicity of peanut protein during hydrolysis

2.2 雙酶水解結(jié)果

雙酶組合水解對花生蛋白質(zhì)水解度的影響見圖3. 由圖3可知，水解8 h后，Alcalase和風味蛋白酶組合水解花生蛋白水解度最高，其次為Alcalase和protease M蛋白酶組合，水解度最低為風味蛋白酶和蛋白復合酶(Protamex)的組合.

雙酶組合水解物致敏性對比情況見圖4. 由圖4可知，雙酶組合水解產(chǎn)物致敏性差異顯著(p<0.05)，Alcalase和風味蛋白酶組合水解致敏性最低為0.49，風味蛋白酶和復合蛋白酶、Alcalase和復合蛋白酶此兩組組合水解物IgE結(jié)合能力最高為0.56.

圖3 雙酶水解對水解度的影響Fig.3 DH of peanut protein hydrolyzed by two enzymes A為Alcalase F為flavorzyme PM為protease M P為protamex

圖4 雙酶組合水解產(chǎn)物致敏性Fig.4 Effect of various hydrolyzates on the allergenicity of peanut protein

P 未水解的花生蛋白;1 Pepsin;2 Papain (S);3 Neutrase;4 Protamex;5 Protease M;6 Flavorzyme;7 Alcalase;8 Alcalase+Flavorzyme;9 Protease M+Protamex;10 Alcalase+Protamex;11 Flavorzume+Protamex;12 Flavorzyme+Protease M;13 Alcalase+Protease M

2.3 蛋白酶水解花生蛋白電泳圖譜分析

單酶和雙酶組合水解花生蛋白電泳圖譜見圖5，除第6泳道風味蛋白酶部分水解Ara h1和Ara h3外，其它泳道Ara h1和Ara h3均已水解完全.

3 討論與結(jié)論

Nondlee等[10]研究表明烘烤花生IgE結(jié)合能力高于原料花生. 花生在烘烤過程中蛋白發(fā)生了復雜的反應產(chǎn)生新的致敏物質(zhì)而增強了致敏性[11],即熱處理的方法可能會引入新的抗原. 因此探索降低烘烤花生脫敏方法具有重要的現(xiàn)實意義.

Chung等[12]研究表明，過氧化物酶(peroxidase, POD)可通過引起花生過敏原Ara h1和Ara h2的聚合反應而降低花生蛋白的致敏性. 過氧化物酶是氧化還原酶的一種，催化從底物移去電子,并轉(zhuǎn)給過氧化氫反應，產(chǎn)生氧化的供體，在蛋白質(zhì)方面，主要表現(xiàn)為引起蛋白質(zhì)的聚合. 從食品科學角度，酶催化后產(chǎn)物的加工特性和感觀特性也是重要的考慮因素，因此，本研究主要選取食品級的蛋白酶作為花生脫敏的工具酶.

不同的蛋白酶具有不同的水解特異，所用酶的種類及酶解條件的不同，會導致酶解產(chǎn)物及抗原性的降低也有所不同. Vieths等[13]模擬胃液對焙烤的花生蛋白進行酶解反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶處理2h后，幾個IgE結(jié)合片斷被SDS-PAGE免疫印跡所識別. Astwood等[14]研究表明，Ara h1經(jīng)胃蛋白酶水解80min后仍可保持高穩(wěn)定性. 本研究所選胃蛋白酶催化部位是Tyr-, Phe-羧基端和氨基端及Leu-,Arg-羧基端，從理論上可以降解過敏原的作用表位，但是胃蛋白酶水解物的抗體滴度值最高，其原因可能有以下幾個方面：一方面胃蛋白酶是外肽酶，不能水解分子內(nèi)肽鍵，分子內(nèi)的抗原決定簇位點得以保存，從而不能有效降低花生的抗原性；另一方面花生蛋白主要抗原決定簇位于分子內(nèi)部，即使是在蛋白結(jié)構(gòu)熱變性的情況下，蛋白酶仍不能有效的催化底物；再有由于蛋白經(jīng)過水解，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變，隱蔽于原分子內(nèi)部的部位裸露于蛋白質(zhì)分子表面，產(chǎn)生新的抗原決定部位，反而增強了其抗原性，證實了Haddad等[15]的研究. 一般認為，致敏原是一些耐熱耐消化的蛋白質(zhì)，具有抵抗胃腸道酶解的作用，胃蛋白酶催化花生蛋白水解物致敏性降低幅度較低，有力的證明了這一結(jié)論.

內(nèi)肽蛋白酶水解蛋白質(zhì)的實質(zhì)就是將底物蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂，釋放出小肽，在初始階段，斷裂的肽鍵數(shù)目很多，敏感性肽鍵快速斷裂，水解速度很快，表現(xiàn)在Alcalase,Protamex,Protease M,Neutrase,木瓜蛋白酶前6個小時水解度增加較快，而水解肽濃度升高，又反過來抑制水解速度，表現(xiàn)為后兩個小時，水解度增加較慢. 外肽蛋白酶不能水解分子內(nèi)肽鍵，分子內(nèi)大量的抗原位點得以保存，所以風味蛋白酶和胃蛋白酶不能有效降低花生蛋白的抗原性.

雙酶組合酶解花生蛋白水解度明顯高于單酶水解物，但是抗體滴度值差異不大，這與酶的特異性有關，只有將抗原抗體結(jié)合的抗原決定簇打斷，才能真正實現(xiàn)降低花生致敏性. 患者血清中的IgE抗體是由未被完全消化的致敏蛋白免疫產(chǎn)生的，當患者產(chǎn)生了IgE抗體后其抗體會與抗原表位結(jié)合，即使致敏蛋白被水解，只要還有殘存的2個以上的表位(10kDa)即可與之結(jié)合而誘發(fā)疾病[4].

加熱和酶解有可能產(chǎn)生隱位而提高過敏原的致敏性[16]. 本研究所選的蛋白酶沒有出現(xiàn)提高過敏原致敏性的現(xiàn)象，這可能與底物蛋白結(jié)構(gòu)的復雜性和蛋白酶催化底物的特異性有關.

Jost等研究表明，水解度與水解產(chǎn)物過敏性之間沒有相關性[17]. 沈小琴[18]也得出同樣的結(jié)論,即水解度和抗原抑制率沒有一定的相關性,水解度高時,抗原抑制率不一定高,而水解度低時,抗原抑制率也不一定低. 本研究對不同蛋白酶水解花生蛋白的水解度和抗體滴度值做相關分析，未得出規(guī)律的相關性，因此，水解度和抗體滴度值之間無相關性.

在單酶、雙酶篩選試驗基礎上，綜合考慮蛋白水解的工藝復雜性及成本，本研究認為Alcalase單酶水解方法為降低烘烤花生致敏性的最佳方案.