自制吸附萃取攪拌棒結(jié)合氣相色譜嗅覺計(jì)、氣質(zhì)聯(lián)用儀分析肉味香精呈香組分

鄧 莉， 邢海鵬， 郝學(xué)財(cái)， 劉 娜， 郭 聰

(天津春發(fā)食品配料有限公司 研發(fā)中心， 天津 300300)

肉味香精在肉制品加工中起著至關(guān)重要的作用，它可以豐富和增強(qiáng)產(chǎn)品的特征香氣，提高產(chǎn)品的吸引力，協(xié)調(diào)產(chǎn)品的香氣使口感更加圓潤、豐滿，掩蔽或修飾產(chǎn)品本身固有的風(fēng)味并且可以降低產(chǎn)品成本[1]. 因此，肉制品行業(yè)的發(fā)展與肉味香精的研發(fā)息息相關(guān)，而肉味香精呈香組分的分析將為香精的研發(fā)提供重要依據(jù).

攪拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction, SBSE)是在固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型樣品前處理技術(shù). 該技術(shù)與SPME一樣具有簡單、高效、快速，重現(xiàn)性好，綠色無溶劑等優(yōu)點(diǎn)，并在萃取過程中吸附攪拌棒自身完成攪拌，避免了在Fiber SPME中攪拌子的競爭吸附，而且其萃取固定相的體積可達(dá)到SPME的50倍以上，因此，富集倍數(shù)明顯提高[2-4]. 目前，國內(nèi)尚無此類商品生產(chǎn)，國外價(jià)格昂貴. 因此，對SBSE技術(shù)的研究是一項(xiàng)十分具有創(chuàng)新性和實(shí)際意義的工作.

熱脫附作為一種快速樣品預(yù)處理技術(shù)，近年來一直受到分析工作者的關(guān)注，在各行業(yè)的應(yīng)用報(bào)道逐年增加，但對咸味香精的風(fēng)味研究尚未見報(bào)道[5].

在儀器檢測中，氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)無疑是香氣分析的首選，由于GC具備對低沸點(diǎn)組分良好的分離性能，結(jié)合MS對于未知化合物強(qiáng)大的定性能力，使得GC/MS在香氣分析中一直發(fā)揮著重要作用. 但香氣物質(zhì)中特征化合物大多數(shù)閾值很低，在進(jìn)行香氣研究時(shí)，即使利用目前最靈敏的檢測器，其靈敏度未必能超過鼻子，鑒定出所有化合物[6-8]. 此外，GC/MS無法用來確定各種香氣化合物對總體香氣貢獻(xiàn)的大小. 氣相色譜嗅覺計(jì)聯(lián)用(GC/O)技術(shù)是解決這些問題的一種理想方法，GC/O技術(shù)是指氣相色譜與嗅覺計(jì)相結(jié)合，香氣組分首先通過GC進(jìn)行分離，再從嗅覺計(jì)出口逐一流出，由嗅辯人員嗅聞加以判斷，確定物質(zhì)種類[9]. GC/O屬于一種感官檢測技術(shù)，即氣味檢測法，其中人的鼻子起到了檢測器的作用. GC/O技術(shù)是用來研究香氣的有力工具，對鑒別特征香氣化合物、香氣活性化合物及用來確定各組分的香氣強(qiáng)度及貢獻(xiàn)很有價(jià)值. GC/O技術(shù)作為一種新型的香氣分析方法，在國外應(yīng)用較多，但國內(nèi)的相關(guān)研究并不多見，特別是利用GC/O、GC/MS兩種方法結(jié)合進(jìn)行對比分析的尚未見報(bào)道.

圖2 溶膠-凝膠法制備SBSE涂層Fig.2 Preparation of SBSE coating by sol-gel method

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肉味香精，來源于市場上認(rèn)可率較高的香精產(chǎn)品；羥基封端二甲基聚硅氧烷(OH-PDMS),分析純，山東萊州鑫泰化工有限公司；甲基三甲氧基硅烷(MTMS)，分析純，湖北武大有機(jī)硅新材料有限公司；含氫硅油(PMHS)，分析純，武漢化工廠；三氟乙酸(TFA)，分析純，天津化工廠；二氯甲烷，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

5975-6890N型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent公司；sniffer 9000系列嗅覺計(jì)，瑞士BRECHBUHLER公司；UNITY熱脫附儀，美國MARKES公司 ；HP-5 ms石英毛細(xì)管色譜柱( 30 m×0.25 mm，0.25 μm)，Agilent公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1吸附萃取攪拌棒的制備

1) 棒體的制作 選取長25 mm，直徑為3 mm的玻璃管，利用酒精噴燈將比棒體略短的鐵芯封于管內(nèi)，攪拌棒結(jié)構(gòu)如圖1.

圖1 吸附萃取攪拌棒Fig.1 Sorptive extraction stir bar

2) 棒體表面的預(yù)處理 依次用CH2Cl2，1 mol/L NaOH溶液，0.1 mol/L HCl溶液對棒體表面進(jìn)行處理，最后用去離子水沖洗至中性，在150 ℃氮?dú)饬飨潞娓?

3) 棒體涂層的制作 取400 mg OH-PDMS加CH2Cl2稀釋，依次加入100 mg PMHS、100 μL MTMS、80 μL TFA充分?jǐn)嚢? 放入超聲清洗儀中超聲30 min以輔助反應(yīng)進(jìn)行. 加熱除去部分溶劑，待溶液成為具有一定黏度的溶膠時(shí)，將步驟2)中處理過的攪拌萃取棒，置于溶膠中30 min取出，完全干燥后，玻管外表面上形成溶膠-凝膠涂層，如此反復(fù)多次，直至涂層達(dá)到所需的厚度為止，室溫下成膠12 h. 其反應(yīng)過程如圖2.

4) 棒體涂層的老化及雜質(zhì)去除 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，進(jìn)行程序升溫老化150 ℃保持4 h，180 ℃保持4 h，然后220 ℃保持60 min，即完成老化. 最后將制作好的攪拌萃取棒在80 ℃蒸餾水中恒溫浸泡2 h, 50 ℃二氯甲烷回流2 h，氮?dú)獯蹈?以除去涂層中未參加反應(yīng)的物質(zhì).

1.3.2攪拌棒吸附采樣

取肉味香精10 g，加入適量去離子水?dāng)噭?，置?0 mL頂空瓶中，放入吸附萃取攪拌棒，攪拌速度500 r/min，萃取，并對萃取溫度及時(shí)間進(jìn)行單因素考察.

1.3.3熱脫附儀進(jìn)樣

將攪拌棒裝入熱脫附儀，預(yù)吹12 min，初級(jí)脫附，脫附時(shí)間5 min，冷阱捕集溫度為-8 ℃，脫附溫度160 ℃，脫附時(shí)間2 min. 傳輸線溫度120 ℃，加熱閥溫度120 ℃，同時(shí)，對初級(jí)脫附溫度進(jìn)行單因素考察.

氣質(zhì)聯(lián)用儀參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣口溫度為230 ℃，不分流，柱流速1.0 mL/min，電離電壓70 eV，質(zhì)量掃描范圍40～400 u，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，輔助溫度230 ℃，檢索譜庫NIST05、自建譜庫，程序升溫梯度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min.

1.3.4分析檢測

本實(shí)驗(yàn)儀器采用在色譜柱出口安裝“石英三通”進(jìn)行1∶1分流，并通過多次實(shí)驗(yàn)調(diào)整兩根出口毛細(xì)管長度，以保證樣品被同時(shí)引入MS和Olfactory(見圖3)，令兩種檢測的出峰時(shí)間盡量保持一致，利于兩種結(jié)果的觀察比對.

圖3 GC/MS—olfactory裝置Fig.3 Figure of GC/MS—olfactory instrument

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 主要影響因素及最佳前處理參數(shù)的確定

2.1.1不同攪拌萃取溫度對萃取效果的影響

在萃取溫度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選擇20，30，40，50，60 ℃五個(gè)梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，萃取60 min，每個(gè)梯度重復(fù)2次取平均值. 各萃取溫度下得到的呈香組分總峰面積如圖4. 結(jié)果表明，低于50 ℃時(shí)溫度對萃取量的影響不大，提高溫度并沒有令萃取量顯著增加，超過50 ℃后，萃取量反而減少，主要由于隨溫度的提高呈香組分在水相中的分配比例降低，部分揮發(fā)到氣相當(dāng)中. 根據(jù)萃取非平衡理論，固定萃取時(shí)間和攪拌速度不變，固定相涂層上待測物的吸附量正比于其在液相中的濃度，因此，選擇室溫作為最佳實(shí)驗(yàn)條件.

圖4 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.1.2不同攪拌棒萃取時(shí)間對萃取效果的影響

本實(shí)驗(yàn)選擇15，30，60，90 min四個(gè)時(shí)間梯度，室溫萃取，每個(gè)梯度重復(fù)2次取平均值，各萃取時(shí)間下得到的呈香組分總峰面積如圖5. 結(jié)果顯示，起初萃取量隨時(shí)間的延長而增加，60 min后再增加萃取時(shí)間，萃取量并無明顯提高. 可見60 min時(shí)已達(dá)到萃取平衡，能夠?qū)⑾銡獬煞殖浞州腿?，因此，選擇60 min作為最佳實(shí)驗(yàn)條件.

圖5 萃取時(shí)間對萃取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.3熱脫附儀不同初級(jí)脫附溫度對前處理效果的影響

將吸附管裝入熱脫附儀，預(yù)吹2 min，初級(jí)脫附溫度分別選擇120，150，180 ℃，脫附時(shí)間5 min，比較不同初級(jí)脫附溫度對提取物總量的影響，如圖6.

結(jié)果表明，脫附溫度為150 ℃時(shí)可將吸附管中的吸附組分充分脫附. 此外，過高的溫度還可能引起組分間的化學(xué)反應(yīng)，令結(jié)果失真. 同時(shí)，由于各種吸附劑熱穩(wěn)定性的限制，所選熱脫附溫度必須低于其極限使用溫度.

圖6 初級(jí)脫附溫度對提取物總量的影響Fig.6 Effect of desorption temperature on extraction efficiency

2.2 分析結(jié)果

肉味香精分析的質(zhì)譜總離子流圖如圖7，MS結(jié)果通過對NIST05庫和自建庫進(jìn)行譜庫檢索得到，GC/O結(jié)果由訓(xùn)練有素的調(diào)香人員嗅聞辨別得到，對于質(zhì)譜庫中不存在物質(zhì)通過質(zhì)譜解析加以確認(rèn)，結(jié)果見表1.

圖7 肉味香精呈香組分的GC/MS總離子流圖Fig.7 Total ion chromatogram of meat flavor aroma components

2.3 質(zhì)譜庫中不存在物質(zhì)的質(zhì)譜解析鑒定

調(diào)香人員通過GC/O嗅辯檢出的巰基丁醇、巰基丁酮等物質(zhì)由于NIST05庫中不存在質(zhì)譜數(shù)據(jù)，不能進(jìn)行譜庫檢索，可以利用質(zhì)譜解析[10]理論進(jìn)行定性. 例如，圖7中6號(hào)峰質(zhì)譜圖如圖8，譜圖中質(zhì)量數(shù)最高的峰為m/z106，與碎片峰m/z91相差15u，與碎片峰m/z88相差18u，為合理中性丟失，據(jù)此判斷m/z106為分子離子峰(偶數(shù))，且主要碎片離子均為奇數(shù)(m/z62除外)，可判斷未知物中不含元素N；根據(jù)分子離子峰的同位素M+2豐度為4.8%，可知未知物中含有1個(gè)S和1個(gè)O; 根據(jù)M+1豐度為4.8%，可知未知物中含有4～5個(gè)C,在上述C，S，O數(shù)量范圍內(nèi)，分子量106u合理的化學(xué)式只能為C4H10SO. 按照式(1)計(jì)算環(huán)加雙鍵值為0，說明未知物中不含環(huán)或雙鍵結(jié)構(gòu)，同時(shí)，由碎片峰M-33(m/z73)可知未知物中含—SH, 由碎片峰M-18(m/z88)可知未知物中含—OH. 因此，推斷此物質(zhì)為巰基丁醇,與GC/O分析結(jié)果一致.

表1 肉味香精呈香組分GC/MS、GC/O分析結(jié)果

分子的環(huán)加雙鍵值=(2X+2+Z-Y)/2

(1)

其中：X=C，S，Si;Y=H，F(xiàn)，Cl，Br，I; Z=N，P

據(jù)此方法，其他NIST05庫中無質(zhì)譜數(shù)據(jù)且被GC/O定性檢出的物質(zhì)均可加以推斷及確認(rèn).

圖8 總離子流圖中6號(hào)峰質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectrum of No.6 peak on TIC

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過溶膠-凝膠法制備的聚二甲基硅氧烷涂層吸附萃取攪拌棒，對吸附質(zhì)有強(qiáng)烈的吸附能力且成本低廉，適用于香精呈香組分的提取. 配合熱脫附儀使用具有簡單、快速、綠色無溶劑等優(yōu)點(diǎn). 該方法相比于傳統(tǒng)的SPME法具有更大的萃取固定相體積，因此，具有較高的靈敏度，特別適合對低含量組分的檢出，在香精香料分析及食品分析領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊.

利用GC/MS、GC/O檢出組分情況如圖9. 圖9及表1結(jié)果顯示，利用GC/MS、GC/O兩種方法共檢出物質(zhì)31種，其中，質(zhì)譜檢出組分26種，聞香器檢出組分24 種. 兩種方法均能檢出的19種物質(zhì)可以確定為此種肉味香精的基本組成，例如其中的3-甲硫基丙醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙基麥芽酚、4-甲基-5-噻唑乙醇等. 僅GC/MS檢出而GC/O未檢出的物質(zhì)共7種，為香精中含量相對較低的物質(zhì)，對呈香貢獻(xiàn)不大. 可能由各組分間的反應(yīng)、非香精類食品添加劑的加入、包裝材料的污染或天然香料的帶入等原因造成，如其中的3-甲硫基丙醛可能由3-甲硫基丙醇氧化而來，BHT為抗氧化劑，鄰苯二甲酸乙脂為塑料容器制造過程中添加的增塑劑，而姜黃烯、沒藥烯等可能由天然辛香料帶入. 僅GC/O檢出而GC/MS未檢出的物質(zhì)共5種，可判斷為香精中低含量、低域值的呈香組分或含量高但NIST質(zhì)譜庫中不存在的物質(zhì)，此類物質(zhì)往往對香氣形成具有重要貢獻(xiàn)，因此不可忽視，如其中的巰基丁醇、巰基丁酮、2，5-二甲基-3-呋喃硫醇等是肉味香精的關(guān)鍵性香料. 可見，GC/O的分析結(jié)果是對GC/MS結(jié)果的重要補(bǔ)充.

圖9 GC/O、GC/MS檢出組分?jǐn)?shù)量Fig.9 Number of detectedcompounds by GC/O and GC/MS

由于GC/O和GC/MS兩種檢測方法對于化合物的鑒別分別依賴于人的感官判斷和儀器的譜庫檢索，兩者的準(zhǔn)確性均在一定程度上存在不足. 本實(shí)驗(yàn)儀器采用在色譜柱出口安裝“石英三通”進(jìn)行1：1分流，樣品被同時(shí)引入MS和Olfactory，通過對兩種分析方法的結(jié)合，消除了兩者的檢測盲點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)；同時(shí)，對于NIST05庫中無質(zhì)譜數(shù)據(jù)且被GC/O定性檢出的物質(zhì)，利用質(zhì)譜解析理論加以確認(rèn)，令檢測結(jié)果更加真實(shí)、準(zhǔn)確，為高級(jí)香精的調(diào)配及仿香工作提供有價(jià)值的參考數(shù)據(jù).