γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的制備及其生物活性

李文娟，馮震，薛曉敏，黃靜，吳自榮

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γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的制備及其生物活性

李文娟，馮震，薛曉敏，黃靜，吳自榮

200062 上海，華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

研究一種低毒性的順鉑復(fù)合物：γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物（γ-PGAasp-CDDP），考察其體外性質(zhì)和體內(nèi)毒性，并探討可能的作用機(jī)制。

γ-聚谷氨酸與天冬氨酸發(fā)生酰胺化反應(yīng)制備 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸復(fù)合物，核磁共振對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；化學(xué)法制備 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物；常規(guī)方法檢測該復(fù)合物穩(wěn)定性；透析法研究藥物緩釋效果；MTT 法檢測復(fù)合物體外抗腫瘤細(xì)胞活性；流式細(xì)胞儀檢測其對細(xì)胞凋亡的作用；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測其體內(nèi)毒性。

成功制備γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物，順鉑的有效結(jié)合率達(dá) 30%；該復(fù)合物在常溫中性環(huán)境下穩(wěn)定；30 h 時(shí)順鉑的累計(jì)釋放率達(dá)到 30%；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合物對 Bcap-37（人乳腺癌細(xì)胞）和 BEL7404（人肝癌細(xì)胞）具有顯著的殺傷作用，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明該復(fù)合物的毒性比游離順鉑低。

γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物仍然保留了游離順鉑的生物活性，在殺傷腫瘤細(xì)胞、引起細(xì)胞凋亡的同時(shí)，大大降低了體內(nèi)毒副作用，其作用機(jī)制可能與實(shí)體瘤組織的高通透性、滯留效應(yīng)（EPR 效應(yīng)）以及藥物緩釋作用有關(guān)，因此該復(fù)合物具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

藥物載體； 藥物釋放系統(tǒng)； 順鉑； γ-聚谷氨酸-天冬氨酸

惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康的主要疾病之一，順鉑[cis-dichlorodiammineplatinum（II），CDDP]類配合物是目前應(yīng)用最為廣泛的抗腫瘤藥物，但因其具有嚴(yán)重的毒副作用，限制了臨床應(yīng)用[1]。將抗腫瘤藥物載于高分子載體上，靶向性輸送到腫瘤組織（即被動(dòng)靶向）[2]，極大地提高了藥物的生物利用率，有效地降低藥物的毒副作用并提高用藥劑量，是目前藥物釋放領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，國外報(bào)道的有微球體、納米微粒、脂質(zhì)體和微型膠囊等[3-7]。本實(shí)驗(yàn)室曾以γ-聚谷氨酸作為載體連接順鉑，制備聚谷氨酸-順鉑復(fù)合物，并取得較好的結(jié)果[8]。但是僅以小分子γ-聚谷氨酸作為載體還存在載藥量低和載體用量大的缺點(diǎn)，本文采用了一種連接效率更高的新型藥物載體：γ-聚谷氨酸-天冬氨酸，利用其活性基團(tuán)羧基連接順鉑，制備γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物，并對其體內(nèi)外性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 H-Asp（OtBu）-OtBu·HCl（Asp，Mr 296.8）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDAC）購自吉爾生化（上海）有限公司；γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、順鉑（CDDP，純度 > 99.9%）、噻唑藍(lán)（MTT）、碘化丙啶（PI）購自美國 Sigma 公司；三氟乙酸（TFA）、鄰苯二胺（OPDA）購自上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.1.2 主要儀器 ELx800 酶標(biāo)儀為美國 Bio-Tek公司產(chǎn)品；FACScan 流式細(xì)胞儀為美國 Becton Dickinson 公司產(chǎn)品；Avance 500 MHz 核磁共振儀為德國 Bruker 公司產(chǎn)品。

1.1.3 細(xì)胞系 枯草芽孢桿菌（．）由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存；Bcap-37 細(xì)胞（人乳腺癌細(xì)胞）、BEL7404 細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）（含 10%小牛血清）購自吉爾生化（上海）有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小白鼠，雌性，5 周齡，體重 18 ~ 20 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，質(zhì)量合格證號：SCXK（滬）2007-0005。

1.2 方法

1.2.1 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸聚合物的合成及結(jié)構(gòu)表征 由枯草芽孢桿菌發(fā)酵得γ-聚谷氨酸[9]，利用溫和降解法[10]，調(diào) pH 至4.0，80 ℃水浴 165 min后冰浴冷卻，調(diào) pH 至中性，透析純化，冷凍干燥得小分子γ-聚谷氨酸（sγ-PGA）。將 sγ-PGA、Asp 及 EDAC 按摩爾比 4:2:3 以蒸餾水充分溶解，攪拌 4 h，離心收集白色沉淀，加 TFA，37 ℃振蕩反應(yīng) 2 h 后，加入 10 倍體積的無水乙醚，離心收集白色沉淀。將得到的固體溶于蒸餾水中，調(diào)pH 至 7.0，透析純化 48 h，冷凍干燥，即得載體γ-聚谷氨酸-天冬氨酸（γ-PGA-asp）。0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳測定其分子量[11]（以下稱電泳法）。

γ-PGA-asp 結(jié)構(gòu)表征：將 15 mg 樣品溶于 500 μl D2O 中，利用Avance 500 MHz 核磁共振儀進(jìn)行核磁共振 H 譜（1H NMR）檢測。

1.2.2 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的制備及分子量測定 將γ-PGA-asp、CDDP 以摩爾比 5:1 混合，去離子水溶解，調(diào) pH 至 7.0，密封，避光 37 ℃溫育 48 h。透析純化 48 h 后，收集樣品，OPDA 法進(jìn)行 CDDP 定量[8]，定量后樣品冷凍干燥，得到白色絮狀產(chǎn)物，即γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物。電泳法測定其分子量。

有效結(jié)合率 =（檢測到的順鉑質(zhì)量/參加反應(yīng)的順鉑總質(zhì)量）× 100%。

1.2.3 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同溫度對 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物的影響 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物樣品 500 μl /管分裝，分別置于 4、37、60 ℃水浴。分別在第 0、10 天取樣，電泳法檢測其載體變化，OPDA 法檢測藥物穩(wěn)定性[8]。

1.2.3.2 不同 pH 值對 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物的影響 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物樣品分別調(diào) pH 至 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，37 ℃水浴，檢測方法同 1.2.3.1。

1.2.4 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物對順鉑的緩釋作用 將 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物溶液（已知 CDDP 濃度 1 mg/ml）加入透析袋中放入 37 ℃磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）中透析 48 h，每隔 1 h 從透析液中取 1 ml 樣品，同時(shí)再加入 1 ml 新 PBS 溶液，每隔 10 h 取樣，用 OPDA 法檢測 CDDP 的量，并計(jì)算其累計(jì)釋放率。

1.2.5 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞的影響

1.2.5.1 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物抑制細(xì)胞增殖作用 將 Bcap-37 和 BEL7404 細(xì)胞分別在 96 孔（l × 104個(gè)細(xì)胞/孔）細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞貼壁去除培養(yǎng)基，再加入含不同濃度游離 CDDP、γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物的新鮮培養(yǎng)基 200 μl /孔，每個(gè)濃度做 4 個(gè)復(fù)孔，置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 24、48、72 h。每孔加入 20 μl 濃度為 5 mg/ml 的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。吸去培養(yǎng)液，加入 200 μl DMSO，充分振蕩，于酶標(biāo)儀波長570 nm 處測定吸光值，并計(jì)算 IC50值。

1.2.5.2 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物對細(xì)胞凋亡的影響 于 25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別培養(yǎng) Bcap-37 和 BEL7404 細(xì)胞，待細(xì)胞長至 80% 時(shí)加 20 μg/ml的藥物作用 24 h，分別設(shè)定對照組（游離 CDDP），實(shí)驗(yàn)組（γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物），處理樣品[11]，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物在正常小鼠體內(nèi)的毒性實(shí)驗(yàn) 昆明雌鼠按體重分為 3 組：PBS 組、游離 CDDP 組及 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物組，每組 10 只。分別于第1、4、7 天以腹腔注射給藥，注射劑量為 4 mg/kg（以 CDDP 計(jì)量）。每天記錄小鼠的存活和體重變化情況。

2 結(jié)果

2.1 藥物載體γ-聚谷氨酸-天冬氨酸的制備及結(jié)構(gòu)表征

由枯草芽孢桿菌發(fā)酵得大分子 γ-聚谷氨酸（γ-PGA），利用溫和降解法制備得小分子聚谷氨酸（sγ-PGA），sγ-PGA、Asp 在 EDAC 催化作用下，發(fā)生酰胺化反應(yīng)，形成復(fù)合物 γ-PGA-asp。透析純化后，冷凍干燥得 γ-PGA-asp，氨基酸分析得 γ- PGA-asp 中γ-PGA:Asp 約為 2 ~ 3:1（摩爾比，數(shù)據(jù)未顯示），合成路線及模式圖見圖 1。

γ-PGA-asp 結(jié)構(gòu)表征1H-NMR（D2O）結(jié)果見圖 2。其中，δ1.95、1.9 ppm 處為 γ-PGA 的 β-CH2-峰，δ2.3 ppm 處為 γ-PGA 的 γ-CH2- 峰，δ4.25、4.41 ppm 分別為 γ-PGA 和 Asp 的 α-CH- 峰，δ2.95 ppm 為 Asp 的 β-CH2- 峰，δ8.06、8.35 ppm 處為 γ-PGA 和 Asp 的 -NH- 峰。該結(jié)果說明 γ-PGA 與 Asp 已連接。

圖 1 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸合成路線及其模式圖

Figure 1 The synthesis route of γ-PGA-asp and its ideograph

圖 2 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸的核磁共振 H 譜

Figure 21H NMR of the γ-PGA-asp

圖 3 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的合成路線模式圖

Figure 3 The synthesis route ideograph ofthe γ-PGAasp-CDDP

2.2 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的制備及分子量測定

CDDP 通過其上的 Cl 原子與載體側(cè)鏈上的活性基團(tuán)羧基反應(yīng)，形成化學(xué)鍵獲得 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物，CDDP 與載體有多種結(jié)合方式，圖 3 模式圖為其中三種類型。OPDA 法檢測 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物中可逆結(jié)合的 CDDP 的量，有效結(jié)合率達(dá) 30%。

電泳法測定復(fù)合物的分子量，結(jié)果如圖 4所示：泳道 4 為載體 γ-PGA-asp，分子量約為 20 ~ 60 kD；泳道 5 為 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物，說明載體 γ-PGA-asp 連接上 CDDP 以后分子量變大，約為 30 ~ 60 kD。

2.3 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的穩(wěn)定性

2.3.1 不同溫度對 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物穩(wěn)定性的影響 圖 5A 顯示，γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物在 4 和 37 ℃下處理 10 d 后，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定無降解（泳道 6、7），而在 60 ℃高溫下有所降解（泳道 5）。且 60 ℃處理的樣品顏色由無色變?yōu)榈S色，說明 γ-PGA-asp 受高溫影響發(fā)生降解，CDDP從復(fù)合物中析出。利用 OPDA 測定 CDDP 的量，結(jié)果見圖 5B，4 和 37 ℃處理 10 d 后 CDDP 的量與未處理前比基本不變，60 ℃處理 10 d 后 CDDP 的量比未處理前降低約 50%。

1 ~ 3：γ-PGA 標(biāo)準(zhǔn)品，分子量分別為 1.45、2.05、6.4 kD；4：γ-PGA-asp，分子量約為 20 ~ 60 kD；5：γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物，分子量約為 30 ~60 kD

1 - 3: Standard γ-PGA with molecular weight 1.45, 2.05, 6.4 kD respectively; 4: The γ-PGA-asp with molecular weight 20 - 60 kD; 5: The γ-PGAasp- CDDP conjugate with molecular weight 30 - 60 kD.

圖 4 γ-PGA-asp 和 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物的瓊脂糖電泳圖
Figure 4 Agarose gel electrophoresis profile of γ-PGA-asp and γ-PGAasp-CDDP conjugate

2.3.2 不同 pH 值對 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物穩(wěn)定性的影響 圖 6A 顯示，γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物在不同 pH 條件下處理 10 d 后，中性條件下基本沒有降解（泳道 5、6、7），pH 9.0 和 10.0 條件下出現(xiàn)降解（泳道 8、9）。圖 6B 顯示，在中性條件下 CDDP 量無明顯變化，而 pH 9.0 和 10.0 條件下與未處理前相比含量明顯降低。

1 ~ 3：γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品；4：γ-PGA-asp；5 ~ 7：分別在 60、37、4 ℃處理 10 d 后的 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物

Figure 5 A: Agarose gel electrophoresis profile of γ-PGAasp- CDDP conjugate influenced by different temperatures for ten days; B: The quantities of CDDP in γ-PGAasp-CDDP conjugate influenced by different temperatures

1 ~ 3：標(biāo)準(zhǔn)品 γ-PGA；4：γ-PGAasp；5 ~ 9：分別在 pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 條件下處理 10 d 的 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物

Figure 6 A: Agarose gel electrophoresis profile of γ-PGAasp- CDDP conjugate influenced by different pH treatmens in water bath for ten days; B: The quantities of CDDP in γ-PGAasp- CDDP influenced by different pH value

2.4 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的緩釋特征

γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物在去離子水中十分穩(wěn)定，放置一個(gè)月不降解、不沉淀，而在含有 Cl–的溶液中，由于 Cl–和 γ-PGA-asp 上的羧基之間發(fā)生交換反應(yīng)，CDDP 從γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物釋放出來，緩釋曲線（圖 7）表明：在前 20 h γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物對 CDDP 有突釋現(xiàn)象，之后釋放趨于平緩，30 h 時(shí)累計(jì)釋放率已達(dá)30%。證明載體連接 CDDP 后的復(fù)合物具有緩釋效果，并且有著較好的釋放率。

圖 7 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物在 37 ℃下 PBS 中對 CDDP 的緩釋曲線

Figure 7 Release profiles of CDDP from the γ-PGAasp- CDDP conjugate in PBS at 37 ℃

2.5 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 MTT 法檢測 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物對細(xì)胞的毒性 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物對 Bcap-37 及 BEL7404 細(xì)胞毒性結(jié)果見圖 8。由圖可知，藥物作用 24、48、72 h 后，細(xì)胞存活率均隨藥物濃度的增大而減小，且成劑量相關(guān)性，但是 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物處理的細(xì)胞存活率均比相同濃度游離 CDDP 處理的細(xì)胞存活率高。此外，表1為藥物對兩種腫瘤細(xì)胞分別作用 24、48、72 h后的 IC50值。從表中可以看出經(jīng) γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物處理的 IC50值普遍高于游離 CDDP 組，高約 2 ~ 3 倍，可見 CDDP 結(jié)合到 γ-PGA-asp 上之后，仍然保留細(xì)胞殺傷作用，但其在細(xì)胞內(nèi)的毒性顯著降低。

2.5.2 FCM 法檢測 γ-PGAasp-CDDP 對細(xì)胞的凋亡作用 20 μg/ml 的 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物對 Bcap-37 和 BEL7404 細(xì)胞作用 24 h，利用FCM 法檢測其對細(xì)胞凋亡的影響，見圖 9，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞經(jīng)藥物處理后有不同程度的凋亡峰出現(xiàn)，處于四倍體細(xì)胞明顯減少，大部分細(xì)胞都被抑制在二倍體期，說明 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物通過抑制 DNA 復(fù)制引起細(xì)胞凋亡，CDDP 結(jié)合到 γ-PGA-asp 上以后，其原有的生物學(xué)活性并未喪失，但與 CDDP 相比復(fù)合物對細(xì)胞凋亡作用相對較弱（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖 8 游離 CDDP 和 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物處理不同時(shí)間后細(xì)胞的存活率曲線（A：Bcap-37 細(xì)胞；B：BEL7404 細(xì)胞）

Figure 8 Cells were treated with free CDDP and γ-PGAasp- CDDP conjugate respectively for different time (A: Bcap-37 cell; B:BEL7404 cell)

表 1 游離 CDDP 和γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物對 Bcap-37 和 BEL7404 細(xì)胞的體外毒性

2.6 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-順鉑復(fù)合物的體內(nèi)毒性

圖 10A 是從正常小鼠體重變化角度來考察藥物的體內(nèi)毒性，研究發(fā)現(xiàn)，游離 CDDP 組小鼠體重在給藥后明顯減低，而 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物組與生理鹽水組小鼠體重均逐漸增加，表明該復(fù)合物毒性很低。圖 10B 顯示游離 CDDP 對正常小鼠毒性非常大，給藥后 10 d 時(shí)小鼠的死亡率為 70%，而 γ-PGAasp-CDDP復(fù)合物對小鼠基本沒有毒性，20 d 后存活率仍為 100%。

圖 9 FCM 法檢測細(xì)胞周期圖（A：Bcap-37 細(xì)胞；B：BEL7404 細(xì)胞）

Figure 9 The results of apoptosis assay (A: Bcap-37cell line; B: BEL7404 cell line)

圖 10 游離 CDDP 和 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物對昆明雌鼠內(nèi)毒性的考察（A：體重變化；B：存活率）

igure 10 The in vivo toxicity of free CDDP and γ-PGAasp- CDDP conjugate in normal KM female mice (A: Body weight change; B: Survival )

3 討論

以微生物發(fā)酵合成的 γ-PGA 作為藥物載體，本實(shí)驗(yàn)室曾成功合成一種半衰期長、毒性低、具有被動(dòng)靶向和緩釋效果的順鉑復(fù)合物：γ-PGA-CDDP 復(fù)合物[8]。但是僅以 sγ-PGA 為載體存在載藥量低和載體用量大的缺點(diǎn)，CDDP 在 γ-PGA 上的載藥量僅能達(dá)到12%。而本研究研制的 γ-PGA-asp 可提高載藥量和降低載體用量，為臨床應(yīng)用提供便利。其作為藥物載體具有以下特點(diǎn)：⑴Asp 的氨基與 γ-PGA 側(cè)鏈的羧基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，組成簡單，結(jié)構(gòu)明確；⑵保持了天然 γ-PGA 安全無毒、生物可降解性和水溶性的特點(diǎn)，提高了藥物的溶解度；⑶具有數(shù)目更多的活性基團(tuán)羧基，且利于藥物與載體的結(jié)合，由于 γ-PGA 上的羧基離主鏈較近，空間位阻較大，不利于 CDDP 的鏈接，而 γ-PGA- asp 在多出 1/3 的羧基的同時(shí)，其距離主鏈較遠(yuǎn)，空間位阻變小，更有利于 CDDP 與載體的結(jié)合。最終得到的 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物中 CDDP 的有效結(jié)合率可達(dá) 30%，有利于解決臨床上載體用量大的問題。

γ-PGAasp-CDDP 不僅保留了順鉑的生物活性，并且有自身的優(yōu)點(diǎn)，其主要表現(xiàn)是：⑴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該復(fù)合物與 CDDP 均具有抗腫瘤細(xì)胞生長效果，但是其毒性明顯低于游離 CDDP 的毒性；⑵小鼠體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 γ-PGAasp- CDDP 毒性低的特點(diǎn)；⑶該復(fù)合物比游離 CDDP 易溶于水，解決了藥物難溶性問題。

本實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步研究 γ-PGAasp-CDDP 在荷瘤小鼠體內(nèi)的抑瘤效果，我們預(yù)測該復(fù)合物會(huì)有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性，主要原因有以下兩點(diǎn)：一方面，EPR 效應(yīng)在腫瘤選擇靶向治療方面發(fā)揮著重要的作用[12]，由于實(shí)體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子類物質(zhì)具有選擇性、高通透性和滯留性，相比正常組織而言，分子量為 30 ~ 60 kD 的 γ-PGAasp- CDDP 復(fù)合物，更容易在惡性腫瘤組織處積累，這種被動(dòng)靶向作用可以在有效地抑制腫瘤增長的同時(shí)也降低毒副作用；另一方面，當(dāng) γ-PGAasp-CDDP復(fù)合物進(jìn)入腫瘤組織后，隨著載體 γ-PGA-asp 的生物降解，CDDP 逐漸從 γ-PGAasp-CDDP 復(fù)合物中釋放出來，這種緩慢的釋放過程不但可以有效地抑制腫瘤組織生長而且延長了藥物在體內(nèi)的半衰期，為高劑量注射藥物提供了可能性，具有潛在地臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Preparation and biological activity of poly(γ-glutamic acid)asp-cisplatin conjugate

LI Wen-juan, FENG Zhen, XUE Xiao-min, HUANG Jing, WU Zi-rong

Author Affiliation:School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200062, China

To prepare a poly(γ-glutamic acid)-Aspartate-Cisplatin conjugate (γ-PGAasp-CDDP). Both properties in vitro and in vivo were investigated and the possible mechanism of action is under discussion.

γ-PGA-asp conjugate was synthesized by amidate reaction between poly-γ-glutamic acids and H-Asp(OtBu)-OtBu·HCl. The characterization of γ-PGA-asp was identified by1H NMR. γ-PGAasp-CDDP conjugate was later prepared by conjugating γ-PGA-asp with Cisplatin. The stability of γ-PGAasp-CDDP was studied by common method, released profile was tested by dialysis, in vitro anti-tumor efficiency was detected by MTT assay, cell apoptosis was investigated by FCM assay and in vivo toxicity was performed in normal mice．

The γ-PGAasp-CDDP conjugate has been successfully synthesized and the active CDDP in the conjugate is up to 30%. γ-PGAasp-CDDP conjugate is solvable and stable in room temperature and neutral environment. CDDP can be gradually released from the resulting conjugate in PBS at 37 ℃ and the accumulative released rate is 30% at 30 h. In vitro, γ-PGAasp-CDDP conjugate performs remarkable anti-tumor effect and induces cell apoptosis on Bcap-37 and BEl7407 cell lines. The in vivo toxicity of γ-PGAasp-CDDP conjugate is significantly lower than free CDDP.

The γ-PGAasp-CDDP conjugate has effective anti-tumor activity, while it strikingly decreases side effects in vivo. The possible mechanism of action may be related to the EPR effect (enhanced permeability and retention effect) and control release function. Therefore γ-PGAasp-CDDP conjugate may have a potential application in clinical treatment.

Drug carriers; Drug delivery systems; Cisplatin; γ-PGA-asp conjugate

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.004

WU Zi-rong, Email: zrwu@bio.ecnu.edu.cn

上海市科委 2008 年度重點(diǎn)科技攻關(guān)專項(xiàng)（08431902400）

吳自榮，Email：zrwu@bio.ecnu.edu.cn

2009-12-02

中國醫(yī)藥生物技術(shù)