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    水產(chǎn)抗氧化肽研究進(jìn)展

    2010-07-12 08:18:36謝寧寧陳小娥方旭波
    關(guān)鍵詞:抗氧化性螯合分子量

    謝寧寧,陳小娥,方旭波,余 輝

    (浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)院、醫(yī)學(xué)院,浙江舟山 316004)

    近年來,抗氧化劑在國內(nèi)外發(fā)展很快,用途也越來越廣。1956年HARMAN[1]提出了衰老的自由基理論(free radical theory of aging)之后,越來越多的人認(rèn)識(shí)到人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老和許多疾病有關(guān)。因此,許多抗氧化劑被用作功能因子開發(fā),應(yīng)用于保健食品及醫(yī)藥等行業(yè)。另外,抗氧化劑能延緩含脂肪食物的腐敗變質(zhì),它也被運(yùn)用于食品保鮮儲(chǔ)藏工業(yè)。

    抗氧化劑的種類很多,其中已經(jīng)被廣泛使用的多為化學(xué)合成類抗氧化劑,由于其具有毒、副作用,各國政府紛紛對其強(qiáng)制規(guī)定了ADI值,控制其添加量[2]。1991年P(guān)ROKORNY[3]提出,一些抗氧化肽和蛋白水解產(chǎn)物能降低自動(dòng)氧化速率和脂肪的過氧化物含量,之后,尋找和制備高活性的蛋白源抗氧化劑,成為新的研究焦點(diǎn)。

    在水產(chǎn)品加工工業(yè)中,不可避免地產(chǎn)生了許多廢棄低值蛋白,采用生物酶工程和發(fā)酵工程等手段,它們可以作為制備抗氧化肽的優(yōu)良備選原料。同時(shí),開發(fā)利用水產(chǎn)副產(chǎn)物中蛋白資源,有利于提高水產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)附加值,降低環(huán)境污染。已經(jīng)有許多研究者從多種水產(chǎn)品中制備出具有抗氧化性的活性肽,本文將針對這方面的研究與進(jìn)展進(jìn)行綜述。

    1 氧化作用的危害及防治

    很多證據(jù)顯示,活性氧(ROS)和自由基在許多退行性疾病如癌癥、動(dòng)脈硬化及糖尿病等中起重要作用[4],它們的形成是呼吸過程中不可避免的。這些自由基非常地不穩(wěn)定,它們能迅速地同機(jī)體中的其它基團(tuán)或物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞或組織的氧化損傷。生物機(jī)體依靠多種由酶系(SOD、GSH-Px、CAT、GST等)和非酶系(葡萄糖、維生素、氨基酸類等)物質(zhì)組成的抗氧化體系,對抗活性氧及自由基。但是,這些防御體系并不能阻止所有氧化損傷。生物體通過補(bǔ)充含有抗氧化物質(zhì)的成分,可以有效地減少氧化損傷對機(jī)體的危害。同樣,在食品工業(yè)中,由于脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致食品產(chǎn)生異味、發(fā)臭和潛在的毒性物質(zhì)等不良后果,容易造成不少經(jīng)濟(jì)損失[5]。通過在食品中添加抗氧化劑,可以有效地對抗脂質(zhì)過氧化,防止食物腐敗變質(zhì),避免浪費(fèi)。

    2 水產(chǎn)品抗氧化肽的原料

    許多研究者對魚類、甲殼類、軟體動(dòng)物進(jìn)行了抗氧化活性的研究。AMAROWICZ和SHAHIDI[6]通過分離毛鱗魚Mallotus villosus蛋白水解液,得到一種在β-胡蘿卜素-亞油酸模型體系內(nèi)具有穩(wěn)定抗氧化活性的組分。SACHINDRA和BHASKAR[7]采用乳酸發(fā)酵蝦Penaeus mondon的廢棄物,制得的產(chǎn)物含有低分子量的蛋白類物質(zhì),并且其具有清除多種自由基和促滅單線態(tài)氧形成的作用。BINSAN等[8]以不同比例混合的去離子水和乙醇為介質(zhì),對白蝦Litopenaeus vannamei頭胸部提取出的抗氧化肽的活性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。QIAN等[9]通過消化牡蠣Crassostrea gigas蛋白,獲得一種由13個(gè)氨基酸殘基組成的抗氧化肽段。

    3 水產(chǎn)品抗氧化肽的制備

    3.1 制備方法

    3.1.1 蛋白酶水解法

    通過酶水解蛋白制備抗氧化肽是目前普遍采用的一種方法。酶促水解反應(yīng)具有條件溫和、易于控制,專一性較強(qiáng)、副反應(yīng)產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。目前報(bào)道中許多水產(chǎn)品抗氧化肽的制備就是采用蛋白酶水解的方法。其中,由于底物的不同,制備抗氧化肽所選用的蛋白酶也不同。表1列舉了部分研究者制備水產(chǎn)品抗氧化肽所選用的酶。

    表1 制備水產(chǎn)抗氧化肽選擇用酶Tab.1 The selection of proteolytic enzymes to prepare aquatic antioxidant peptides

    另外,除采用外源蛋白酶外,有學(xué)者利用魚類含有的內(nèi)源性蛋白酶,制備出水產(chǎn)抗氧化肽。SAMARANAYAKA和CHAN[19]利用太平洋鱈魚Merluccius productus肉中感染寄生蟲Kudoa paniformis產(chǎn)生的蛋白酶水解活性,制備鱈魚肉抗氧化肽,其中E-1h FPH組分在亞油酸自氧化體系中的抗氧化活性高于BHA和α-生育酚。JE等[20]采用自制的“鮐魚腸天然酶(MICE)”水解狹鱈Theragra chalcogramma魚排蛋白,魚排蛋白水解產(chǎn)物(APH)被分成5種分子量大小不同的組分,其中分子量最小的APH-V組分具有最高的抗氧化活性,通過純化之后的多肽樣品濃度為53.6 μmol/L時(shí),羥自由基清除率為35%。

    3.1.2 發(fā)酵法

    許多水產(chǎn)品經(jīng)發(fā)酵后,在微生物和內(nèi)源酶的作用下,有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成了小分子物質(zhì)如肽類、氨基酸類和其它含氮化合物。其中的多肽和氨基酸不僅對發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味起重要貢獻(xiàn),而且對產(chǎn)品的抗氧化功效起到貢獻(xiàn)作用。發(fā)酵法與酶解法相比,能將微生物產(chǎn)酶和酶水解兩步合一,省去酶的分離和提純步驟,減少生產(chǎn)工序,降低成本。

    RAJAPAKSE等[21]通過分離純化紫貽貝Mytilus edulis發(fā)酵液,制備出具有重復(fù)序列“HFGBPFH”的多肽,經(jīng)檢測其具有較高的自由基清除能力、Fe2+螯合能力及提高氧化損傷細(xì)胞成活率的作用。PERALTA等[22]研究了菲律賓傳統(tǒng)食鹽發(fā)酵的蝦Acetes spp醬的抗氧化性,結(jié)果證明通過適當(dāng)延長發(fā)酵時(shí)間,在有效地增加自由氨基酸含量的同時(shí),也提高了蝦醬的抗氧化能力。

    3.2 分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

    從目前報(bào)道的水產(chǎn)品抗氧化肽來看,分子量多集中在1 000 Da左右,氨基酸殘基的數(shù)目一般在20個(gè)以內(nèi),而且,在抗氧化肽粗品中,肽的種類較多,活性肽組分對外界環(huán)境條件也比較敏感,因此,分離純化較困難,通常采用單一的分離純化手段不能達(dá)到理想的分離效果。目前,普遍采用多種分離技術(shù)聯(lián)用的手段。一般的分離純化流程如圖1所示。

    圖1 分離純化流程圖Fig.1 The flow chart of isolation and purification

    超濾(UF)是膜分離技術(shù)的一種,實(shí)踐證明膜技術(shù)具有耗能低、設(shè)備小、操作管理方便和質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。近年來,超濾技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于水產(chǎn)品抗氧化肽的分離純化。MENDIS等[13]采用10 kDa,5 kDa和3 kDa 3種膜截留魷魚皮明膠水解產(chǎn)物,初步篩選出小于3 kDa分子量的抗氧化活性最強(qiáng)組分。

    離子交換色譜(IEC)是多肽分離純化過程中經(jīng)常采用的方法,它是以離子交換劑為固定相,根據(jù)流動(dòng)相中組分離子與交換劑上平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí),結(jié)合力大小差異而進(jìn)行分離的一種層析方法。很多的研究者采用SP-Sephadex C-25陽離子交換色譜分離水產(chǎn)品抗氧化活性組分。如狹鱈Theragra chalcogramma魚排[20]、巨魷魚Dosidicus gigas肉[14]超濾活性組分等。

    凝膠層析(GC)又稱凝膠排阻色譜、分子篩層析和凝膠過濾等,是利用分子大小和形狀差異進(jìn)行分離的一種溫和、高效的方法。Sephadex G-25凝膠柱層析是分離小分子量水產(chǎn)抗氧化肽采用的最多的一種,如乳酸發(fā)酵蝦Penaeus mondon廢棄物[7]。另外,有學(xué)者采用Superdex Peptide10/300 GL凝膠柱純化牛蛙Rana catesbeiana Shaw[12]皮和草魚Ctenopharyngodon idellus[15]水解物。

    為了獲得活性最高的多肽純化物,通常采用高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行分離純化驗(yàn)證。高效液相色譜是近年來肽的分離純化中廣泛應(yīng)用的技術(shù),主要用于10 kDa以下的極性小分子肽的分離純化。RAJAPAKSE等[21]采用nucleosil 100-7 C18 HPLC柱和Zorbax SB C18 HPLC柱兩步分離,制得962 Da的活性最高抗氧化肽純品。KIM等[16]將離子交換層析后的活性最高組分進(jìn)一步經(jīng)HPLC分離,分別采用了1次Capcell Pak C18UG-120柱和2次Synchropak RPP-100 RP-HPLC analytical柱,制得抗氧化肽純品。對最終制得的高純度抗氧化肽,通常采用質(zhì)譜(CM)進(jìn)行分子量的測定,推測其氨基酸序列。

    4 水產(chǎn)抗氧化肽活性評(píng)估方法

    評(píng)估水產(chǎn)抗氧化肽的活性,一般采用自由基清除能力、抗脂質(zhì)自氧化能力、金屬離子螯合能力、協(xié)同抗氧化能力等多種評(píng)價(jià)方法進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)評(píng)估。經(jīng)篩選出的具有抗氧化活性的物質(zhì)可通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步檢驗(yàn)評(píng)估。

    4.1 清除自由基

    自由基是指一類可以獨(dú)立存在的含有未配對電子的物質(zhì),包括分子、原子、原子團(tuán)或離子。主要包括超氧陰離子(O2-·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH·)、單線態(tài)氧(1O2)等,這些自由基具有不穩(wěn)定性和高反應(yīng)性。抗氧化劑可以有效地將泄漏出來的、多余的活性氧等清除掉,從而保護(hù)細(xì)胞、組織免遭氧化損傷。

    目前抗氧化肽的自由基清除效果,普遍采用自由基清除率來表示。二苯代苦味酰肼自由基 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,簡稱DPPH)是一種較穩(wěn)定的自由基。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí),DPPH自由基的單電子被分配而使其顏色變淺,利用分光光度法可以檢測自由基清除情況,從而評(píng)價(jià)樣品抗氧化能力。羥自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧自由基,它帶有1個(gè)不成對的電子,是對人體毒性最大的自由基,它反應(yīng)速度極快,可以與活細(xì)胞中的大分子如蛋白和DNA發(fā)生反應(yīng)而造成損害[23]。因此,較多的研究者選用以上2種自由基的清除率來評(píng)估水產(chǎn)蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性。

    除此之外,超氧陰離子自由基[24]、過氧化氫自由基[25]等的清除率也被一些學(xué)者作為綜合評(píng)價(jià)水產(chǎn)多肽抗氧化能力的選擇方法。

    4.2 抑制脂質(zhì)自氧化

    脂類的自氧化是造成食品質(zhì)量下降最主要的化學(xué)因素之一。尤其是富含不飽和脂肪酸的食品,很容易氧化生成過氧化脂質(zhì),再經(jīng)過分解、聚合等反應(yīng)產(chǎn)生腐敗直至出現(xiàn)毒性。另一方面,在生物體內(nèi),癌癥的發(fā)生以及衰老也都與體內(nèi)脂肪的氧化有關(guān)。因此,脂類常作為被氧化的底物用來檢測樣品的抗氧化能力。

    水產(chǎn)抗氧化肽抑制脂質(zhì)自氧化的效果,一般采用以亞油酸為氧化底物的亞油酸模型系統(tǒng)。亞油酸通過吸收空氣中的氧進(jìn)行自動(dòng)氧化反應(yīng),產(chǎn)生脂肪酸氫過氧化物。水產(chǎn)抗氧化肽的添加,可以抑制自氧化反應(yīng)。通過比較兩種情況下的氫過氧化物的含量,來評(píng)估抑制脂類自氧化的效果。很多報(bào)道均采用硫氰酸鐵法[26]檢測氫過氧化物的含量。該法的原理是亞鐵離子可被氫過氧化物氧化成高鐵離子,其反應(yīng)為Fe2++2H++O→Fe3++H2O,然后加入硫氰酸銨與Fe3+形成紅色的絡(luò)合物,其在540 nm處有強(qiáng)吸收值,通過比色即可測出氫過氧化物的含量。

    4.3 金屬離子螯合能力

    過渡態(tài)金屬離子如Fe2+和Cu2+能催化不飽和脂質(zhì)氧化過程中自由基的形成[27],而水解產(chǎn)生的多肽的羧酸基團(tuán)和氨基基團(tuán)具有金屬離子螯合能力,因此,能夠削弱脂質(zhì)的氧化。由于水解過程中多肽的斷裂,導(dǎo)致了肽片段濃度的增加,從而有助于清除羥自由基中的金屬離子,產(chǎn)生抗氧化性。

    DONG等[10]研究了鰱魚蛋白水解物的金屬離子螯合活性。隨著水解時(shí)間的增加,水解產(chǎn)物的螯合活性增強(qiáng)。其中,在任何時(shí)間段時(shí),堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物的活性均比風(fēng)味蛋白酶高。經(jīng)堿性蛋白酶水解6 h的水解物的金屬離子螯合活性最高,達(dá)92.97%。并且螯合活性和水解度(DH)之間存在線性關(guān)系。結(jié)果證明低分子量的水解產(chǎn)物具有較高的金屬離子螯合活性。

    4.4 協(xié)同抗氧化性

    在水產(chǎn)品水解物中也有協(xié)同抗氧化活性肽的報(bào)道。這類抗氧化肽本身的抗氧化能力比較低,但是在與其它一些抗氧化劑同時(shí)使用時(shí),具有很強(qiáng)的抗氧化效果。JE等[20]研究了狹鱈魚排的水解產(chǎn)物,經(jīng)超濾膜過濾后的5種組分中,僅APH-Ι無協(xié)同抗氧化性,其它組分在亞油酸模型系統(tǒng)中均具有同α-生育酚的協(xié)同抗氧化性。

    4.5 細(xì)胞損傷模型

    最近幾年,越來越多的研究者采用細(xì)胞損傷模型評(píng)估抗氧化活性。氧化作用在細(xì)胞的損傷死亡中扮演重要角色,通過添加抗氧化劑對抗細(xì)胞中產(chǎn)生的氧化作用,能夠提高細(xì)胞的成活率。MENDIS等[13]通過建立人工培養(yǎng)的人類肺臟纖維細(xì)胞模型,采用MTT法,檢測t-BHP介導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞的成活率,結(jié)果顯示,在與天然抗氧化劑α-生育酚相比時(shí),魷魚皮明膠多肽能顯著提高細(xì)胞成活率。

    4.6 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

    通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證樣品的抗氧化性,是活性評(píng)估中最重要的一環(huán)。通常將受試物連續(xù)飼喂大鼠或小鼠1-3月,然后處死,測定其血或組織(如肝、腦)中MDA、單胺氧化酶(MAO-B)及抗氧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及過氧化氫酶(CAT),同對照組比較,若 MDV、MAO-B 降低,SOD、GSH-Px、CAT 等升高,則說明受試物具有抗氧化能力。

    林琳和李八方[28]研究了具有清除自由基作用的魷魚多肽的體內(nèi)抗氧化活性。采用D-半乳糖致衰的小鼠模型,結(jié)果表明分子量小于2 kDa的多肽組分,能夠提高小鼠血液及皮膚中SOD和GSH-Px的活力,降低MDA含量,并提高小鼠皮膚中Hyp的含量。

    5 影響水產(chǎn)抗氧化肽活性的因素

    5.1 水解過程因素

    通過水解制備出的抗氧化肽的活性與底物原料、酶的種類、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶的加入量、pH、以及酶解產(chǎn)物的水解度(DH)等許多因素有關(guān)。

    KLOMPONG等[18]采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解黃斑紋鲹魚蛋白制得2種水解產(chǎn)物分別為HA和HF。采用不同的酶,活性宜有變化。當(dāng)水解度增加時(shí),HA的DPPH自由基清除活性和還原能力增強(qiáng),HF并無此現(xiàn)象。HA和HF的金屬離子螯合能力均隨著水解度的增加而增強(qiáng)。并且,在相同的水解度時(shí),HF的金屬離子螯合能力通常比HA高。在低水解度(DH=5%)時(shí),HA的DPPH自由基清除活性較好,同時(shí),在高的水解度(DH=25%)時(shí),HF的還原能力較好。也有研究者研究了堿性蛋白酶處理的鰱魚蛋白水解產(chǎn)物,羥自由基清除活性和亞油酸過氧化抑制率分別在水解時(shí)間為1.5 h和2.0 h時(shí)達(dá)到最大值,證明鰱魚水解蛋白抗氧化能力是與水解度和水解時(shí)間相關(guān)[10]。

    表2 水產(chǎn)抗氧化肽的序列結(jié)構(gòu)及分子量Tab.2 The peptide sequence and molecular weight of aquatic antioxidant peptides

    5.2 肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)

    抗氧化肽的功能特性較多地受分子結(jié)構(gòu)和分子量的影響[29,30]。MURASE等[31]認(rèn)為,抗氧化肽的疏水性增強(qiáng)了它的抗氧化性和乳化效果,并且,這類多肽在同非肽類抗氧化劑協(xié)同時(shí)具有比較強(qiáng)的協(xié)同效果。CHEN等[32]認(rèn)為組氨酸含量較高的多肽,具有金屬離子螯合作用。另外,一些其它的氨基酸,比如,組氨酸、脯氨酸、丙氨酸和亮氨酸,被報(bào)道對自由基清除有貢獻(xiàn)作用[33]。SUETSUNA等[30]報(bào)道了亮氨酸出現(xiàn)在C端具有抗氧化性,并認(rèn)為在多肽結(jié)構(gòu)中芳香族氨基酸的酚羥基基團(tuán)能夠作為有效的電子供體。MENDISA等[13]報(bào)道了魷魚皮明膠抗氧化肽P1和P2的抗氧化性來源于序列中富含間隔的“親水-疏水”序列,同時(shí),由于分子量較低,P1比P2具有更高的抗氧化特性。表2為部分水產(chǎn)抗氧化肽的序列結(jié)構(gòu)及分子量。

    另外,除以上兩方面外,抗氧化肽所處的pH、溫度等外界條件同樣影響活性的發(fā)揮。BISAN等[8]研究表明,白蝦抗氧化肽,在pH 2~11,溫度為25~100℃范圍內(nèi),F(xiàn)ARP、TBARS和DPPH 3種活性仍然高于80%?;钚噪脑?00℃加熱30 min時(shí),3種活性稍微降低,30~120 min時(shí),3種活性維持在80%左右,120~150 min時(shí),DPPH活性稍微降低。

    6 水產(chǎn)抗氧化肽研究展望

    我國是水產(chǎn)品加工大國,每年都會(huì)產(chǎn)生大量的低值水產(chǎn)品下腳料蛋白資源,開發(fā)利用水產(chǎn)抗氧化肽將具有不菲的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)意義。水產(chǎn)抗氧化肽能有效地清除體內(nèi)的活性氧自由基,保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能,同時(shí)防止食品脂質(zhì)過氧化變質(zhì),在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。但水產(chǎn)抗氧化肽的研究中仍有不少問題需要解決。第一、有關(guān)抗氧化能力的測定方法很多,但是通用的方法很少,使得各種實(shí)驗(yàn)缺乏可比性,需統(tǒng)一抗氧化能力測定標(biāo)準(zhǔn);第二、水產(chǎn)抗氧化肽單一組分和不同組分協(xié)同作用的機(jī)制等還有待深入研究;第三、有關(guān)水產(chǎn)抗氧化肽的活性研究大多缺乏臨床試驗(yàn),體內(nèi)抗氧化機(jī)理還需要進(jìn)一步深入研究;第四、對于水產(chǎn)抗氧化肽在濃縮干燥過程中的活性損失,還缺乏系統(tǒng)性的深入研究;第五、在抗氧化肽分離純化的研究中,鹽的存在一定程度上會(huì)影響抗氧化活性的測定,但是脫鹽問題一直沒能得到很好的解決;第六、目前的分離純化手段很難純化得到分子量很小、由2~3個(gè)氨基酸組成的肽段,這也是大多數(shù)研究報(bào)道所得到的抗氧化肽分子量都大于500 Da的原因之一。

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