五倍子、烏梅等45種中草藥提取物對鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用研究

邱慶連 ，潘清清，2，張友平，3，劉 問，錢 冬*

（1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313000；2.浙江省三門縣海洋與漁業(yè)局，浙江三門 317100；3.浙江省紹興縣農(nóng)業(yè)局，浙江紹興 312000）

弧菌是海水養(yǎng)殖的主要病原菌，可引起海水養(yǎng)殖魚類、蝦蟹和貝類的多種疾病[1,2]，給海水養(yǎng)殖造成了極大的經(jīng)濟損失。目前對于弧菌病的控制，還是采用以抗生素為主的化學藥物治療方法，抗生素的使用造成了嚴重的菌株耐藥問題，環(huán)境耐藥菌株的產(chǎn)生對人類健康造成了潛在的危害[3,4]。中草藥具有無抗藥性和藥物殘留、副作用小等優(yōu)點，加上中草藥資源豐富，近年來在水生動物病害控制方面日益受到人們的關注[5,6]。某些中草藥還有促進機體生理代謝，提高機體抗病能力等作用[7]。

鋸緣青蟹俗稱青蟹，是浙江省重要的海水養(yǎng)殖蟹類。浙江省青蟹養(yǎng)殖年產(chǎn)量達到近3萬t，占全國總產(chǎn)量1/3。近年來，沿海養(yǎng)殖鋸緣青蟹長期受到病害的威脅。2006年青蟹全國平均發(fā)病率為13.77%，死亡率5.43%，全國青蟹因病害造成經(jīng)濟損失達2億余元[8]。研究表明，弧菌是鋸緣青蟹較為常見的分離菌株[9,10]，也是青蟹重要的繼發(fā)病原，是引起青蟹養(yǎng)殖死亡的重要原因之一。作者從三門發(fā)病青蟹中也分離到較多的菌株，部分菌株對青蟹有較強的致病力。為從中草藥來源中尋找可能的抗菌活性組份，減少抗生素等化學藥物的使用，作者研究了45種常用中草藥提取物對鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

擬態(tài)弧菌Vibrio mimicus SM060818、梅氏弧菌V.metschnikovii SM060813、霍利斯弧菌V.hollisae SM060913為本實驗室分離自浙江三門發(fā)病鋸緣青蟹。

1.2 試驗儀器、藥物和試劑

試驗用離心機為Sigma 3K-15；藥物稱量精密電子天平為賽多利斯產(chǎn)品；細菌培養(yǎng)箱為上海精宏產(chǎn)品，細菌培養(yǎng)搖床為江蘇太倉，高壓滅菌鍋為上海博迅公司產(chǎn)品。

試驗用五倍子、川芎等45種中藥購自湖州市慕韓齋藥堂，用中藥粉碎機充分粉碎后陰涼干燥處保存?zhèn)洹?/p>

抑菌試驗用空白藥敏濾紙片及營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂購自杭州天和生物技術有限公司，培養(yǎng)基使用時添加1%NaCl，均高壓滅菌備用。

1.3 中草藥的制備

1.3.1 藥物水提取法[11]

取粉碎中藥5 g，加水至75 mL，4℃浸泡12 h后，煮沸后用文火煎煮30 min，濾出煎液，再加相同體積的水煎煮。合并3次煎煮液，加熱濃縮至7 mL，12 000 r/min離心10 min，取上清4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 藥物醇提取法

取粉碎中藥1 g，加5 mL 95%乙醇，浸泡，60℃水浴1 h，取上清4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 中草藥提取物的藥敏紙片制備[12]

分別取水提取法和醇提取法制備的藥液上清，取20 μL滴加于直徑6 mm的空白紙片上，50℃充分烘干備用。

1.5 中草藥提取物的抑菌測定

采用紙片擴散法（K-B法）進行[13]，實驗菌株經(jīng)添加1%NaCl的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)28℃18 h后，取菌液100 μL加至1%NaCl的營養(yǎng)瓊脂平板上，用三角玻棒均勻涂布；將制備好的中草藥提取物藥敏紙片貼于涂布好菌液平板，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h；測量并記錄抑菌圈直徑。

1.6 中草藥提取物的最小抑菌濃度（MIC）測定

試驗在添加1%NaCl的營養(yǎng)肉湯中進行，方法參照文獻[11]試管2倍稀釋法，本文采用96孔微量2倍稀釋法測定進行:各個待測藥物設10個稀釋度,每個濃度設3個重復；每個培養(yǎng)孔中加入125 μL含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，隨后加入稀釋菌液25 μL濃度為6×106CFU/mL試驗菌液，使最終菌濃度達到1×106CFU/mL；28℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結果，以完全抑制待測菌生長的最低藥物濃度作為最低抑菌濃度（MIC）。

待測中草藥提取物的藥物濃度采用干燥稱重法確定，準確量取1.00 mL中草藥提取物，加至1.5 mL離心管中，80℃烘箱烘干，稱干重。

2 結果

2.1 中草藥提取物對擬態(tài)弧菌抑菌活性

采用瓊脂平板紙片擴散法（K-B法）對45種中草藥提取物對青蟹分離菌進行的抑菌活性進行了體外檢測，結果發(fā)現(xiàn)五倍子、烏梅、艾葉、天冬、秦皮、虎杖、知母等28種中草藥提取物都有一定的抑菌效果；千里光、穿心蓮等17種中藥提取物對分離菌株無抑制作用。分析水提取法和醇提取法成份的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)大部分中草藥在2種提取液中都可存在抑菌活性成份，以水提取法的活性高于醇提取法；青蒿的水提取物對擬態(tài)弧菌SM060818無明顯的抑菌活性，而醇提取物存在較強的抑菌活性（表1）。

表1 45種中草藥提取物對擬態(tài)弧菌的抑菌作用Tab.1 Antibacterial effect of 45 Chinese herbs extractions to Vibrio minicus

2.2 中草藥提取物對3種青蟹分離弧菌的抑菌活性

分析28種中草藥提取物對3種青蟹分離弧菌的抑菌活性，結果表明：五倍子、烏梅、秦皮、艾葉等提取物抑菌作用較好，對3種分離菌株均有較好的抑菌效果；天冬、白頭翁、赤芍、金銀花、黃精、黃柏、青蒿等中草藥僅對其中1～2個菌株有抑制作用(表2)。同時還發(fā)現(xiàn)，擬態(tài)弧菌分離株SM060818對各類中藥提取物的抑菌靈敏度更好，霍利斯弧菌分離株SM060913相對不敏感，而梅氏弧菌的分離株SM060813則相對耐藥。表2為抑菌活性較強的22種中藥對3種弧菌分離株的抑菌試驗結果。

表2 中草藥提取物對3種青蟹分離弧菌的抑菌活性Tab.2 Antibacterial effect of Chinese herb extractions to Vibrio isolates from Scylla serrata

2.3 中草藥提取物對青蟹致病弧菌的最小抑菌濃度（MIC）

從紙片擴散試驗中選取有較好抑菌效果的9種中草藥提取液，測定其對3種弧菌的最小抑菌濃度（MIC），結果見表3。由表3可見，這些提取物中以五倍子提取物的抑菌效果最好，對擬態(tài)弧菌、梅氏弧菌和霍利斯弧菌等的MIC分別為0.172 mg/mL、0.172 mg/mL和0.086 mg/mL，其次是烏梅提取物，對3種弧菌的 MIC 分別為 0.461 mg/mL、0.461 mg/mL 和 0.922 mg/mL，其他提取物的 MIC 范圍在 1.04～167 mg不等（表3）。

表3 9種中草藥提取物對青蟹分離弧菌的最低抑菌濃度（mg/mL）Tab.3 The MIC of 9 Chinese herbs extraction to Vibrio isolates from S.serrata

3 討論

本文對45種中草藥，采用水煎煮法和乙醇法進行了提取，用紙片擴散法分析了45種中藥提取物對青蟹致病性弧菌進行了抑菌測定，結果表明：試驗的45種中藥提取物有28種中藥提取物對1種以上的青蟹致病弧菌表現(xiàn)出抑菌作用，其中五倍子、烏梅、秦皮、艾葉等各種提取物對擬態(tài)弧菌SM060818、梅氏弧菌SM060813、霍利斯弧菌SM060913等3種菌株均有較好抑菌作用；天冬、白頭翁、赤芍、金銀花、黃精、黃柏、青蒿等中草藥可對其中1～2種菌株有抑制作用。測定五倍子、烏梅、天冬等對致病弧菌的最低抑菌濃度(MIC)，其中五倍子和烏梅等藥物對擬態(tài)弧菌和梅氏弧菌的MIC分別為0.172 mg/mL、0.461 mg/mL，這些結果為抗弧菌中藥有效成份的研究提供了有益線索。

養(yǎng)殖青蟹近年來受到各類疾病的危害，白斑綜合征病毒(WSSV)、血卵渦鞭蟲以及弧菌等感染占青蟹病害的大多數(shù)[14,15]，其中弧菌的分離有較多的報道[9,10]。從作者近年來對青蟹分離菌株種類和分布來看，傾向于認為弧菌是青蟹重要的繼發(fā)病原，在環(huán)境脅迫或其他病原感染時加劇青蟹的發(fā)病死亡。尋找有抗弧菌活性中草藥，結合免疫增強劑的應用，對提高青蟹病害控制水平將起到積極作用，還可避免減少單一使用抗菌藥引起的藥物次級污染等危害，在青蟹養(yǎng)殖中有重要的應用價值。

近年來，抗生素誘導的細菌耐藥性受到愈來愈多的關注[3,4]，抗生素的使用限制也日益嚴格，中草藥來源抗菌藥物的應用將日益受到廣大研究者的關注。中藥和其他天然抗菌活性物質是潛在新抗菌藥物的前導化合物，抗菌活性成份的化學特性研究受到廣泛的關注。就本研究測試的45種中藥而言，水煎煮法所提取抑菌成份明顯優(yōu)于醇提取法，說明抑菌成份多為水性溶性成份，其特點為容易溶解和提取，但后期純化和結構闡述較為困難，同時水煎煮法過程長、能耗大，還存在不耐熱活性成份被破壞的風險，需要采用超聲波、微波等新提取技術。此外，從中藥提取物對弧菌的最低抑菌濃度（MIC）來看，效果最好的五倍子對弧菌MIC為0.172 mg/mL，抑菌效果大大低于目前常用抗菌藥物，這是由于中藥成份較為復雜，直接抗菌成份含量較少而致。許多中藥不同程度地存在免疫增強和機理調理等成份，不能以簡單抑菌作用強弱來評價一種中藥提取物的藥用價值。通過加強對五倍子、烏梅等有較好抗菌力中藥活性成份提取和抑菌機理研究，對于尋找有潛力的抗菌化合物，有重要的應用價值。

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