響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取葎草總黃酮的工藝研究

董江濤，李 燕，徐慧強(qiáng)，蔣橙華

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

葎草[Humulus scandens（Lour.）Merr.]為?？迫劜輰俨荼局参颷1]。野生于田間路邊，又名烏爪龍、拉拉藤、過膚龍等，廣泛分布于我國大部分地區(qū)[2]。藥理研究證明，其具有抗茵、抗炎、止瀉抑菌、降壓、鎮(zhèn)痛等作用[3]。已報(bào)道的從葎草全草中分離出的主成分為黃酮類化合物[4]。但是，葎草黃酮的提取鮮有報(bào)道，并且提取得率差別很大，因此本研究期望通過響應(yīng)曲面法的優(yōu)化，在獲得較高的提取得率同時(shí)，也測(cè)定出葎草中黃酮的含量。

微波輔助提取技術(shù)是利用微波場(chǎng)的生物效應(yīng)、熱效應(yīng)及“擾動(dòng)”效應(yīng)來加速物質(zhì)的擴(kuò)散溶解，有效地提高化合物提取的得率與含量。微波輔助提取技術(shù)用于黃酮類化合物的提取時(shí)具有選擇性高、提取時(shí)間短、溶劑用量少、后處理方便耗能低、對(duì)環(huán)境安全無害等優(yōu)點(diǎn)[5]。試驗(yàn)以黃酮的提取得率為指標(biāo)，對(duì)微波功率、提取時(shí)間和液料比的單一和交互作用等進(jìn)行研究，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)微波提取葎草黃酮的條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到微波輔助提取的最佳工藝參數(shù)，為葎草黃酮的提取及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葎草：11月中旬采自安徽亳州，自然晾干；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ-UV2000紫外可見分光光度計(jì)，（尤尼柯儀器有限公司）；XH-MC-1微波催化合成萃取儀（北京祥鵠高科技發(fā)展有限公司）；sartorius BS210S電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；多功能粉碎機(jī)（廣東佛山市方勝電器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（H2050R-1長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；微量移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 制備提取液 葎草60℃恒溫烘干，粉碎，過20目篩，準(zhǔn)確稱取塊狀碎片1.0 g，加入60%乙醇，微波輔助提取，提取液經(jīng)抽濾、離心后于50 mL容量瓶中以60%乙醇定容，搖勻待用。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取0.010 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品以60%的乙醇溶解后，定容到50 mL容量瓶中得到0.200 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別準(zhǔn)確量取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 此標(biāo)準(zhǔn)液于8個(gè)25 mL容量瓶中，依次分別加入1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；1.0mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后靜置 6 min；10.0 mL 4%的NaOH溶液，用60%的乙醇稀釋到刻度，靜置15 min。在510 nm處測(cè)定吸光度（A），以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定與計(jì)算 黃酮含量測(cè)定采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法，其原理是黃酮類化合物經(jīng)亞硝酸鈉還原后，與硝酸鋁絡(luò)合生成穩(wěn)定的紅橙色化合物，此化合物在510 nm處有最大吸收，然后以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)，通過測(cè)定吸光度計(jì)算含量。

準(zhǔn)確移取1.0 mL的樣品液于50 mL容量瓶中，其余操作同1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算，按以下公式計(jì)算總黃酮得率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察了微波功率、液料比、提取時(shí)間、乙醇濃度等4個(gè)因素，在各自5個(gè)水平上的提取得率，具體參數(shù)見表1。

表1 單因素試驗(yàn)考察因素及水平

（1）微波功率對(duì)提取得率的影響。在液料比20∶1、提取時(shí)間20 min、乙醇濃度60%的條件下，考察微波功率對(duì)葎草黃酮提取得率的影響。

（2）提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響。在液料比20∶1、乙醇濃度60%、微波功率為420 W的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)葎草黃酮提取得率的影響。

（3）液料比對(duì)提取得率的影響。在提取時(shí)間20 min、乙醇濃度60%、微波功率為420 W條件下，考察液料比對(duì)葎草黃酮提取得率的影響。

（4）乙醇濃度對(duì)提取得率的影響。在液料比20∶1、提取時(shí)間20 min、微波功率為420 W條件下，考察乙醇濃度對(duì)葎草黃酮提取得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì) 應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果做響應(yīng)曲面研究，建立葎草黃酮提取得率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。三個(gè)自變量微波功率、提取時(shí)間和液料比分別以X1、X2和X3代表，以＋1、0、－1分別代表各自的不同水平，每個(gè)變量按方程進(jìn)行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，ΔX為自變量的變化步長。試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂捎枚味囗?xiàng)式表達(dá)為：

Y 為葎草黃酮提取得率的響應(yīng)值，Ai、Aii、Aij為模型的相關(guān)系數(shù)，Xi、Xj（i≠j）為自變量編碼值，響應(yīng)面法設(shè)計(jì)的編碼因素及水平見表2。

表2 響應(yīng)面法分析因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1中可以看出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=9.412 2C－0.005 4（R2=0.999 7），其中 C 為黃酮濃度（mg/mL），A為吸光度，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 微波功率對(duì)提取得率的影響 由圖2中可知：在較低的微波功率條件下，黃酮的提取率隨微波功率的增強(qiáng)而顯著增加，但微波功率達(dá)到420 W后，黃酮提取率會(huì)降低，是因?yàn)檫^高的微波功率下溫度升高明顯，使得蛋白質(zhì)變性，阻礙了黃酮的溶出。此外乙醇會(huì)沸騰，沸騰的乙醇蒸汽冷凝回流的時(shí)間過程間接地縮小了液料比，使得乙醇與葎草沒有充分接觸，黃酮沒能完全溶出。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 微波功率對(duì)提取得率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響 在10～25 min的時(shí)間內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮的得率不斷升高，浸提時(shí)間在25 min時(shí)，黃酮提取得率達(dá)到最大值，25 min后開始下降。原因是浸提起始時(shí)，葎草與溶劑接觸充分，黃酮能夠充分溶解，但隨著時(shí)間的延長，微波會(huì)促進(jìn)黃酮的氧化，因此，葎草黃酮較佳的提取時(shí)間為25 min。

2.2.3 液料比對(duì)提取得率的影響 從圖4可以看出，當(dāng)液料比從10∶1擴(kuò)大至20∶1時(shí)，總黃酮的得率增加趨勢(shì)非常明顯，在20∶1時(shí)達(dá)到最大值，之后開始減小，這是由于液料比擴(kuò)大可以增加物料與溶劑的接觸面積，使得黃酮類物質(zhì)更充分的溶解出來，過多的溶液會(huì)吸收微波從而降低了微波對(duì)黃酮溶解的促進(jìn)作用。另外液料比過大也會(huì)溶解出過多的雜質(zhì)，不僅耗損了大量的試劑，也給后來的純化工作帶來困難，所以確定最佳液料比為20∶1。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取得率的影響

圖4 液料比對(duì)黃酮提取得率的影響

2.2.4 乙醇濃度對(duì)提取得率的影響 由圖5可知隨著乙醇濃度的升高，總黃酮得率隨著升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值。隨著濃度進(jìn)一步提高，總黃酮含量逐漸降低。是因?yàn)橐掖紳舛冗^高時(shí)，一些親脂性強(qiáng)的成分等溶出增多，并與總黃酮競(jìng)爭地與乙醇-水分子結(jié)合，干擾黃酮的溶出。

圖5 乙醇濃度對(duì)黃酮提取得率的影響

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 響應(yīng)面設(shè)計(jì)中，以微波功率、提取時(shí)間和液料比為參數(shù)，葎草黃酮的提取得率為響應(yīng)值，進(jìn)行了3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值很接近，模型適應(yīng)性高。利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到葎草黃酮提取得率（Y）對(duì)編碼自變量：微波功率（X1）、提取時(shí)間（X2）和液料比（X3）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

表3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

Y=1.82+0.068 X1+0.040 X2+0.043 X3－0.046 X1X2－0.066 X1X3－0.033 X2X3－0.17 X12－0.078 X22－0.085 X32。

從表4黃酮得率回歸模型方差分析（ANOVA）可以看出：F回=21.9＞F0.01（9.4）=14.8，p=0.000 3，表明模型極其顯著。黃酮得率F失擬=1.04＜F0.05（9.3）=8.81，失擬項(xiàng)p=0.47＞0.05，表明失擬不顯著。模型一次項(xiàng)微波功率（X1）（p=0.001 6）、提取時(shí)間（X2）（p=0.027 7）、液料比（X3）（p=0.016 2）顯著；二次項(xiàng)均顯著；交互項(xiàng)X1X2（p=0.047 6）、X1X3（p=0.011 0）；X2X3（p=0.130 4）不顯著。

表4 回歸方程系數(shù)及顯著性檢查

Design Expert軟件中Box-Behnken法計(jì)算葎草黃酮得率回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)（AdjR-squared）RAdj2=0.9217，即該模型能解釋92.17%響應(yīng)值的變化，說明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，說明響應(yīng)曲面法優(yōu)化葎草總黃酮的提取條件是可行的。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析 利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及其響應(yīng)面見圖6～8。根據(jù)二次模型所得到的等高線及響應(yīng)曲面的形狀可以評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互作用強(qiáng)度，以及確定各因素的最佳水平范圍。

由圖6可知：當(dāng)液料比為20∶1，提取時(shí)間不變的條件下，微波功率在400W～420W范圍內(nèi)增大時(shí)，葎草黃酮提取得率急劇增加，并在420 W附近達(dá)到極大值而后緩慢降低，與單因素試驗(yàn)結(jié)果吻合。

圖6 提取時(shí)間、微波功率的等高線和響應(yīng)曲面圖

由圖7可知：提取時(shí)間不變的條件下，固定微波功率，曲線呈現(xiàn)陡峭增加后平滑遞減的規(guī)律，說明液料比在較低的水平下對(duì)葎草黃酮提取得率影響大于較高水平下的影響。

圖7 微波功率、液料比的等高線和響應(yīng)曲面圖

由圖8可知：微波功率固定的條件下，液料比不變的情況下，葎草黃酮提取得率受提取時(shí)間的影響顯著，表現(xiàn)為先升高后降低的較陡曲線。

圖8 提取時(shí)間、液料比的等高線和響應(yīng)曲面圖

等高線的形狀可反映出因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用顯著，而圓形則相反。響應(yīng)曲面坡度的陡峭程度表現(xiàn)響應(yīng)值對(duì)因素變化的敏感性。圖6、圖7可以看出等高線呈橢圓，說明提取時(shí)間和微波功率、微波功率和液料比之間交互影響顯著，響應(yīng)面陡峭說明提取得率對(duì)提取時(shí)間、微波功率和液料比的變化敏感[6-9]。

對(duì)回歸方程求導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即3個(gè)主要因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為：微波功率422.81 W、提取時(shí)間25.89 min、液料比20.82∶1，此時(shí)葎草總黃酮的得率達(dá)1.83%。

2.4 模型驗(yàn)證

對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，選擇的條件為微波功率420 W.、提取時(shí)間為 26 min、液料比 21∶1，黃酮的得率分別為 1.68%、1.74%、1.72%、1.69%、1.75%，平均為1.73%，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，偏差不大，吸光度測(cè)量值穩(wěn)定說明每次測(cè)定的黃酮含量穩(wěn)定，證明該結(jié)果是合理可靠的。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過響應(yīng)曲面法的優(yōu)化，得到了影響微波輔助提取葎草黃酮的各因素的顯著性，以及因素之間相互作用的關(guān)聯(lián)程度，并且得到了提取的最佳作用條件：微波功率422.81 W、提取時(shí)間25.89 min、液料比20.82∶1，此時(shí)葎草總黃酮的得率達(dá)1.83%，模型經(jīng)驗(yàn)證后結(jié)果穩(wěn)定偏差不大，說明響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取葎草黃酮是可行的。

[1]侯寬昭.中國種子植物科屬詞典[M].北京：科學(xué)出版社,1984：238.

[2]龔麗霞，丁卓平.葎草及黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009.37（4）：1618-1620.

[3]倪士峰，則 惠，魏 博，等.葎草藥學(xué)研究[J].吉林中醫(yī)藥2009，29（2）：162-163.

[4]李俊婕，王曉靜，付義成.葎草化學(xué)成分的研究食品與藥品2008，l0（05）：5-7.

[5]唐浩國.黃酮類化合物研究[M].北京：科學(xué)出版社，2009.42.

[6]吳華勇，黃贛輝，顧振宇，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化竹葉總黃酮的提取工藝研究[J].食品科學(xué)，2008，29（11）：196-200.

[7]宋江峰，李大婧，劉春泉.響應(yīng)曲面法優(yōu)選人工蛹蟲草多糖微波提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（5）：1143－1150.

[8]Liu J C,Shu M,Wen X C,et al.Optimization of polysaccharides（ABP）extraction from the fruiting bodies of Agaricusblazei Murill using response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers，2009，78（5）：704-709.

[9]Wang S J,Chen F,Wu J H,et al.Optimization of pectin extraction assisted by microwave from apple pomace using response surface methodology[J].Journal of Food Engineering,2007,78（2）：693-700.

[10]李尼曼，鐘曉紅，李麗娜，袁智俊.金櫻子黃酮類化合物提取工藝研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,（3）：79-82.