一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選和誘變

蔣瓊鳳 ，張金金 ，周 斌 ，謝達平 ，黃光文

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.湖南科技學院生命科學與化學工程系，湖南 永州 425100）

纖維素是植物材料的主要成分，也是地球上最豐富的可再生資源，它曾被指望用于解決人類的食品、能量和環(huán)境問題，但目前這些生物量除了用于燃燒和造紙等以外很少有其它的用途[1]。將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘?、乙醇、甲烷等容易利用的小分子有機物是國際上重大課題之一[2]。國內(nèi)外科研工作者已先后篩選和培育了許多產(chǎn)纖維素酶的菌種，其中木霉屬菌株產(chǎn)生的纖維素酶活力較高。由于其粗酶制劑中含有較高活力的酶，因而成為當前生產(chǎn)上應用較多的菌種。但與淀粉酶和蛋白酶相比，其生產(chǎn)規(guī)模小，酶的活力也較低，酶解效率不高[3-4]。因此，篩選酶活力高且穩(wěn)定的野生菌株，以及對篩選的菌株進行誘變處理提高其酶活力具有重要的現(xiàn)實意義。筆者擬從自然環(huán)境篩選具有較好產(chǎn)纖維素酶活力的野生菌株，誘變出酶活提高較大的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土 樣 菜地、造紙廠、枯木、竹林土、樹林樹葉土，牛糞、腐爛的谷殼和秸稈下的腐殖土，廢棄蘑菇培養(yǎng)基、苗圃土。

1.1.2 試 劑 0.1 mol/L、pH值 4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液：稱取檸檬酸21.014 g、檸檬酸鈉29.412 g溶于500 mL去離子水中，待溶解之后定容至1 000 mL，再用pH計調(diào)節(jié)其pH值至4.8。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）：稱取10 g CMCNa 溶于 500 mL、pH 4.8（0.1 mol/L）檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，待溶解之后用緩沖液定容至1 000 mL。DNS試劑的配制參考文獻[5]。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）篩選培養(yǎng)基。NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，CMC-Na 15 g，蒸餾水 1 L，pH 值 5.5～6.0，瓊脂 15～20 g，2%去氧膽酸鈉溶液 20 mL（預先滅菌，臨用前加入），鏈霉素溶液（10 000 U/mL）3.3 mL（臨用前加入）。（2）濾紙條培養(yǎng)基。參考文獻[6]并稍加改動：無機鹽液（KH2PO42 g，（NH4）2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnSO41.7 mg，CoCl21.7 mg，吐溫-80 1 mL，加蒸餾水定容到 1 L，pH 5.5～6.0。（3）固體發(fā)酵培養(yǎng)基。固體料（稻草粉∶麩皮∶豆粕粉∶玉米粉=4∶2∶2∶1），無機鹽液同濾紙條培養(yǎng)基，固料∶無機鹽液=1∶2.5。于250 mL的三角瓶中加入9 g固體料和22.5 mL上述無機鹽液并用玻璃棒攪拌均勻，加棉塞121℃滅菌1 h。

1.2 方法

1.2.1 稻草纖維素的制備及濾紙的預處理 制備與預處理參考文獻[7]進行。

1.2.2 菌種篩選 菌種初篩：菌種的分離純化[8]，待菌種純化后再將純種點種到初篩培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)4 d，用2 g/L的剛果紅染色30 min，再用適量的1 mol/L NaCl脫色30 min，測量菌落和水解圈的直徑并計算酶的相對比活力：A=水解圈直徑/菌落直徑。

菌種復篩：取斜面培養(yǎng)的孢子接入固體發(fā)酵三角瓶，28℃條件下培養(yǎng)2 d，扣瓶，發(fā)酵108 h左右取酶液測定其CMC酶活和FPA酶活。

1.2.3 酶液的制取 固體發(fā)酵培養(yǎng)基，向三角瓶固體曲加入一定量的雙蒸水（按干曲重量加水10 mL/g）于室溫、160 r/min振蕩1～2 h，用雙層紗布過濾，4 000 r/min離心15 min，上清液為粗酶液，適當稀釋后測定還原糖濃度。固曲的換算[9]：取鮮曲5 g于105℃烘干，測定其含水量。

1.2.4 酶活力的測定 （1）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）酶活力。以1%CMC-Na溶液為底物，在50℃，pH值4.8的條件下，1 h分解CMC-Na產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量，定義為一個CMC酶活單位，以U/g（干曲）表示。測定方法：取1%CMC-Na溶液2 mL于10 mL的離心管中，放入50℃水浴鍋中預熱5 min后加入0.5 mL適當稀釋的酶液，50℃恒溫酶解反應30 min；取0.5 mL反應后的酶液和1.5 mL DNS于試管，將試管沸水浴15 min，冷卻后加入10 mL去離子水，搖勻，于540 nm比色測定OD值。根據(jù)吸光度從葡萄糖標準曲線中查出相應的葡萄糖含量，根據(jù)生成的葡萄糖含量計算出CMC-Na酶活值。

（2）濾紙（FPA）酶活力。以濾紙為底物，在pH值4.8，50℃恒溫條件下，1 h分解濾紙產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量，定義為一個濾紙酶活單位，以U/g表示。測定方法：將定性濾紙（新華濾紙1 cm×6 cm）卷成小卷，放進10 mL的離心管中，加入檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH值 4.8）2 mL放入50℃水浴鍋中預熱5 min后，再加入1 mL適當稀釋的粗酶液，輕輕搖勻，使濾紙完全浸泡在液體中，50℃保溫1 h；然后取0.5 mL反應后的酶液和1.5 mL DNS于試管，將試管沸水浴15 min，冷卻后加入10 mL去離子水，搖勻，于540 nm比色測定OD值。根據(jù)吸光度從葡萄糖標準曲線中查出相應的葡萄糖含量，根據(jù)生成的葡萄糖含量計算出濾紙酶活值。

1.3 紫外誘變

制備好的孢子懸液在紫外燈20 W，照射距離24 cm條件下進行誘變，誘變時間分別為20～180 s（間隔為20 s）。到達照射時間后，用移液槍吸取0.1 mL并稀釋涂平板，每個照射時間的依次稀釋到104/mL、103/mL、102/mL 3個梯度，每個梯度吸取 0.1 mL涂平板。用黑色塑料袋包好，避光，29℃倒置培養(yǎng)。2～3 d后挑取長勢較好的單菌落接PDA斜面培養(yǎng)，以備進一步篩選。

1.4 誘變菌株的篩選

酶活等的測定方法與上述的菌株篩選同。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩

初篩過程中，在CMC-Na平板能夠長出明顯的菌落的真菌大多可以看到明顯的水解圈，但有的菌落雖然長勢較好，但沒有水解圈。測量其水解圈和菌落的直徑，結(jié)合二者比值及菌株的生長狀況選擇其中較好的16株真菌，分別進行劃線分離、編號并保藏于固體斜面培養(yǎng)基上，為下一步復篩做準備。

2.2 菌株的復篩

對初篩得到的16株真菌搖瓶復篩分別測出這些真菌的CMC酶活值和FPA酶活值并且觀察它們的濾紙崩解情況，最后得到了一株酶活力較高的菌株zzh7。

從 圖 1 中 可 以 看 出 ，zzh2、zzh3、zzh5、zzh7、zzh8、zzh11、zzh13、zzh14、zzh15 的 CMC 酶活值在16株真菌中較高，其中zzh5的最高，為3 134.54 U/g，zzh7為2 972.53 U/g。從圖2中可以看出，zzh2、zzh5、zzh7、zzh8、zzh14的 FPA 酶活值在 16株真菌中較高，其中zzh7的最高，為203.86 U/g，zzh5為128.33 U/g。從表1中看出，zzh7等11株濾紙崩解的較厲害，zzh4、zzh7、zzh10濾紙崩解為不定形。試驗結(jié)果表明，zzh7為酶活力較高的野生菌株。

圖1 不同真菌的CMC酶活力值

圖2 不同真菌的FPA酶活力值

表1 不同真菌的濾紙的崩解情況

2.3 紫外誘變結(jié)果分析

圖3和圖4所示，突變菌株z1～z5的各組酶活與出發(fā)菌株相比都有不同程度的提高。其中z1菌株酶活力的提高幅度最大，CMC-Na酶活力、FPA酶活力分別達3 554.88 U/g、506.76 U/g，比出發(fā)菌株相應提高1.19倍和2.48倍。其中FPA的提高最大，說明纖維素酶系中3種酶，即纖維二糖水解酶（C1）、葡聚糖內(nèi)切酶（CMCase）和 β－葡萄糖苷酶（β-Glase）的協(xié)同作用增強了，意味著對纖維素的降解能力有較大程度的提高。由圖5、圖6可知，z1傳代后纖維素酶活力值高且穩(wěn)定。

圖3 不同菌株的CMC酶活力值

圖4 不同菌株的FPA酶活力值

圖5 z1傳代的CMC酶活值

圖6 z1傳代的FPA酶活值

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過CMC固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，剛果紅染色、NaCl脫色，根據(jù)透明圈直徑和透明圈直徑與菌落直徑之比的大小及酶活測定，初篩出產(chǎn)纖維素酶活力較高的真菌16株。通過搖瓶發(fā)酵復篩，獲得了產(chǎn)纖維素酶活較高且酶活力穩(wěn)定的真菌1株，命名為zzh7。在紫外照射160 s、致死率為87.2%條件下獲得的一株突變株z1，其CMC酶活力為3 554.88 U/g、FPA酶活力為506.76 U/g，較出發(fā)菌株分別提高了19.59%、148.58%。z1傳代后纖維素酶活力值高且穩(wěn)定。

3.2 討論

3.2.1 菌株與酶活 我國目前纖維素酶生產(chǎn)的菌株，其 FPA 酶活僅為 100 μmol/g·h[10]。張建強[11]分離的脈紋孢菌（Neurospora sp.）FPA酶活為386.7 μmol/g·h，CMC 酶活為 3551.1 μmol/g·h。鄔敏辰[12]研究的綠色木霉的FPA酶活達到555 μmol/g·h。而筆者在篩選的zzh7的濾紙酶活值達到203.86 U/g、CMC酶活為2 972.53 U/g，經(jīng)紫外誘變后的z1濾紙酶活值達到506.76 U/g、CMC酶活為3 554.88 U/g。zzh7和z1與張、鄔所研究的菌株相比較，z1的CMC酶活與張的相差很小，但FPA酶活卻明顯大于張，與鄔的FPA酶活相似。因此，筆者得到的這兩個菌株酶活比較高，屬于高酶活菌株。

3.2.2 水解圈與酶活 纖維素分解菌目前普遍采用的分離方法是剛果紅法[13]。一般情況下，纖維素剛果紅培養(yǎng)基用于識別產(chǎn)纖維素酶菌株和初步判定酶活性高低：產(chǎn)酶愈多，水解圈愈大；產(chǎn)酶越快，水解圈則出現(xiàn)越早[14]。但水解圈的大小并不是判斷菌株產(chǎn)纖維素酶活高低的唯一依據(jù)。筆者發(fā)現(xiàn)，在篩選的過程中有的菌落長勢較好但無水解圈，有的透明圈小但酶活大，這與姚強、馮健玲觀察到的現(xiàn)象一致[15－16]。其原因有很多方面，如固體和液體培養(yǎng)條件不同；不同菌株具有不同的生長和產(chǎn)酶速度以及不同的纖維素酶系；菌苔大小及其在平板上堆積情況的差異等，都會造成透明圈大小與液體發(fā)酵酶活結(jié)果的不完全一致[17-18]。

3.2.3 吐溫-80與酶產(chǎn)量 真菌產(chǎn)生的纖維素酶屬于胞外酶。胞外酶必須分泌到細胞外才能充分發(fā)揮作用，因此改變細胞膜的通透性能提高酶產(chǎn)量。表面活性劑能改變細胞膜的通透性提高酶的產(chǎn)量，但離子表面活性劑對細胞是有毒性的，而少量非離子表面活性劑可以提高酶的產(chǎn)量[19]。因此，吐溫-80可作為培養(yǎng)基添加物質(zhì)來提高酶的產(chǎn)量。劉穎和許曉鵬的研究均表明，0.05%～0.1%的吐溫-80可顯著提高纖維素酶活力[20－21]。筆者根據(jù)出發(fā)菌株zzh7的生長特點選擇在培養(yǎng)液中添加0.1%吐溫-80，實驗表明能夠提高纖維素酶的產(chǎn)量。

3.2.4 菌種鑒定與培養(yǎng)條件優(yōu)化 研究得到的菌株zzh7的菌落形態(tài)與18S rDNA的ITS序列數(shù)據(jù)支持其是一個新的菌種，此內(nèi)容另文發(fā)表。

由于纖維素酶系是一類復雜的復合誘導酶，不同的底物對纖維素酶活力會有很大的影響[22]。大量研究證明，不同的碳源、氮源及不同的濃度都會對纖維素酶系中的各組分酶活有促進作用；不同的培養(yǎng)條件（pH值、溫度、濕度等）也會對其有較大的影響。筆者所使用的固體發(fā)酵培養(yǎng)基是根據(jù)相關(guān)文獻設(shè)計的，該培養(yǎng)基還有待完善。因此，zzh7及其誘變后菌株z1最佳產(chǎn)酶的基質(zhì)組分和培養(yǎng)條件還有待進一步研究。確定該菌株最佳的產(chǎn)酶條件后，其纖維素酶活力有望進一步提高。

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