微量波動Ames試驗在卷煙煙氣毒理學(xué)評價中的應(yīng)用研究

鄒 琳 ，潘秀頡 ，吳維佳 ，劉姜瑾 ，徐 龍 ，楊陟華 ，周冀衡 ，朱茂祥

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與健康重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司公司技術(shù)中心，湖南 長沙 410014）

自1975年鼠傷寒沙門氏菌突變試驗（Ames試驗）創(chuàng)建以來[1]，國內(nèi)外發(fā)表了大量科學(xué)文獻(xiàn)，確認(rèn)Ames試驗為一種簡便快速初篩環(huán)境誘變劑或致癌物的方法。目前，其已成為在世界范圍內(nèi)基因毒性測試中應(yīng)用最為廣泛的一種方法，通常是體外毒理學(xué)測試的第一步[2]。此方法在創(chuàng)建伊始就檢出卷煙煙氣凝聚物具有致突變性[3-4]。2002年，國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）卷煙煙氣體外毒性測試工作組推薦采用此方法評價卷煙產(chǎn)品的相對毒性[5]。

傳統(tǒng)Ames試驗采用平板法，存在敏感性低的缺點。1976年Green等通過改良Ames試驗發(fā)明了波動試驗（Fluctuation test）[6]，有研究表明該方法的靈敏度比Ames試驗高100倍[7-8]。1978年Gatehouse又將其改進(jìn)為微量波動試驗方法（Microtitre fluctuation test），并已證明此方法更為靈敏[9]。筆者采用微量波動試驗方法和傳統(tǒng)的Ames平板滲入法檢測了4種卷煙煙氣凝聚物致突變性，以考察不同烤煙原料的致突變性、不同添加劑添加量對卷煙致突變性的影響和微量波動試驗在卷煙煙氣毒理學(xué)評價中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗所用非商品卷煙均由湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。共4個處理，其中1號煙和2號煙為同一產(chǎn)地烤煙制成的單料卷煙，其中1號煙的原料為B2F，2號煙的原料為X3F；3號煙和4號煙為同一葉組配方卷煙，但2種煙的某一添加劑的添加量不同。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

1.2.1 主要儀器設(shè)備 JJ100型單通道吸煙機(jī)（由中國煙草總公司鄭州煙草研究院生產(chǎn)）；YJ-875凈化工作臺（蘇州工業(yè)園區(qū)三興凈化科技有限公司），MLS-3020高壓滅菌鍋（SANYO公司），101A-3型干燥箱（上海市實驗儀器總廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器儀表公司）；低溫冰箱（Thermo Format公司）；低溫高速離心機(jī)（KUBOTA公司）；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2.2 主要試劑 牛肉膏（Ausable），胰胨（OXOID），葡萄糖-6-磷酸鹽（SIGAMA），氧化性輔酶-Ⅱ（ROCHE），組氨酸（SIGAMA），生物素（SIGAMA），氯化鈉，磷酸氫二鈉，氯化鉀，氯化鎂，磷酸氫鈉銨，檸檬酸，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，溴甲酚紫。

1.3 卷煙煙氣凝聚物（CSC）的制備

設(shè)定JJ100型單通道吸煙機(jī)的抽吸周期為60 s、抽吸時間為2 s，連接好密封的兩個玻璃氣體采樣器，第一個氣體采樣器內(nèi)盛有95%的乙醇5.0 mL，第二個氣體采樣器內(nèi)盛有5.0 mL蒸餾水，點燃香煙，將卷煙的煙氣導(dǎo)入氣體采樣器管，然后按設(shè)定的速率，連續(xù)收集10支卷煙。待最后一支吸完，氣體采樣器管內(nèi)氣體完全吸收后，將兩管中的收集液混在一起，并用乙醇洗滌氣體采樣器，與前混合液混和在一起，定容至10.0 mL容量瓶中，搖勻后分裝在0.5 mL EP管中，放至液氮罐中儲藏。此CSC的濃度為1.0支煙/mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗菌株 選取對卷煙煙氣敏感的TA98和TA100兩個菌株[10]，試驗前均經(jīng)性狀鑒定合格。

1.4.2 微粒體酶制備 用Aroclor 1254誘導(dǎo)大鼠按AMES法制備S9混合液。

1.4.3 平板滲入法 在預(yù)先保溫45℃的2 mL軟瓊脂中加入0.1 mL CSC，0.1 mL測試菌株，0.5 mL S9混合物，充分混勻后倒入底層培養(yǎng)基上鋪平[11]。每一個試驗樣品做3個平皿，每皿CSC加入量分別為 6.25、12.50、25.00、50.00 μL。最后將試驗平皿放入溫箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)48 h，分別記錄回變菌落數(shù)并取其平均值。

1.4.4 微量波動法 96孔板中每孔加入50 μL含500個細(xì)菌的受試菌混合物（1×Vogel-Bonner鹽緩沖液，16 g/L葡萄糖，0.002 g/L組氨酸，0.000 3 g/L生物素，0.024 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.006 6 mol/L氯化鉀，0.001 6 mol/L氯化鎂，0.001 mol/L葡萄糖－6－磷酸，0.000 8 mol/L輔酶Ⅱ，2%肝S9液及相應(yīng)濃度受試物）。各受試物分別采用6.25、12.50、25.00、50.00 μL/板濃度進(jìn)行測試，每種濃度每種菌接種48個孔，37℃孵育16 h后加入選擇培養(yǎng)基150 μL（1×Vogel-Bonner鹽緩沖液，8 g/L 葡萄糖，0.006 7g/L溴甲酚紫），繼續(xù)培養(yǎng)72 h后觀察，孔內(nèi)培養(yǎng)物由紫色變?yōu)辄S色為陽性[12-14]。

1.4.5 結(jié)果判定 計數(shù)每種菌每種CSC每個濃度的突變菌落數(shù)或陽性孔數(shù)，以濃度為橫坐標(biāo)，突變菌落數(shù)或陽性孔數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，比較不同樣品的相對毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種Ames試驗方法測定4種卷煙CSC致TA98菌突變性結(jié)果

圖1 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA98菌株的致突變結(jié)果

分別用平板滲入法與微量波動法檢測4種卷煙樣品CSC對鼠傷寒沙門氏菌TA98菌株的致突變性，結(jié)果如圖1所示，對同一卷煙樣品，2種Ames試驗方法檢測的卷煙煙氣細(xì)菌致突變性均有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。4種不同樣品的卷煙，2種Ames試驗方法檢測的卷煙煙氣細(xì)菌致突變性結(jié)果一致，即2號卷煙對TA98菌的致突變性最低，1號和3號卷煙相當(dāng)，4號卷煙最高。進(jìn)一步分析2種檢測方法的實驗結(jié)果，線性范圍和劑量效應(yīng)曲線如表1所示，與傳統(tǒng)的平板法計數(shù)結(jié)果比較，微量波動法檢測結(jié)果的線性范圍更寬，單位劑量致突變率更低，表明試驗的靈敏性更高（為平板法的2倍以上）。

表1 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA98菌株的致突變性結(jié)果分析比較

2.2 2種Ames試驗方法測定4種卷煙CSC致TA100菌突變性結(jié)果

圖2 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA100菌株的致突變結(jié)果

分別用平板滲入法與微量波動法檢測4種卷煙樣品CSC對鼠傷寒沙門氏菌TA100菌株的致突變性，結(jié)果如圖2所示，與TA98菌的檢測結(jié)果相似，2種Ames試驗方法檢測的卷煙煙氣細(xì)菌致突變性結(jié)果一致，即1號和2號卷煙對TA100菌的致突變性相當(dāng)，3號卷煙居中，4號卷煙最高。進(jìn)一步分析2種檢測方法的實驗結(jié)果，線性范圍和劑量效應(yīng)曲線如表2所示，與傳統(tǒng)的平板法計數(shù)結(jié)果比較，微量波動法檢測結(jié)果的線性范圍更寬，單位劑量致突變率更低，表明試驗的靈敏性更高（為平板法的4倍以上）。

表2 平板滲入法和微量波動法測定4種卷煙CSC對TA100菌株的致突變性結(jié)果分析比較

3 討論

傳統(tǒng)的Ames平板滲入法采用半固體培養(yǎng)液，在有外源致突變物存在的情況下，組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生回復(fù)突變，回復(fù)為野生型，可在無組氨酸的培養(yǎng)基生長。故可根據(jù)菌落形成數(shù)量，檢查受試物是否為致突變物[15]。微量波動試驗（Microtitre fluctuation test）的基本原理與傳統(tǒng)Ames試驗相似，不同的是在微量波動實驗中，培養(yǎng)系統(tǒng)采用液體培養(yǎng)基，在96孔板中培養(yǎng)，并通過細(xì)菌代謝產(chǎn)物導(dǎo)致培養(yǎng)基酸堿性變化，用酸堿指示劑進(jìn)行結(jié)果檢測。外源化合物致突變能力越強(qiáng)，變色的孔數(shù)越多。微量波動法的全液體測試環(huán)境使得S9及受試物等在測試環(huán)境下仍可繼續(xù)作用一定的時間，從而使得可誘變受試菌的代謝物增加，Ames突變率增加，增強(qiáng)靈敏性。

本實驗采用微量波動法和平板滲入法分別測定了4種供試卷煙CSC的致突變性。結(jié)果顯示，隨著CSC加入量的增加，2種方法測定的突變性均呈劑量依賴性的增強(qiáng)。表明微量波動法測定的結(jié)果與平板滲入法測定的結(jié)果具有一致性，微量波動法應(yīng)用于卷煙的安全性評價具有一定的可靠性和實用性。而從結(jié)果中可以看出，對于致突變性相近的CSC，平板滲入法在受試物較高濃度才能顯示出差別，而微量波動法在受試物低濃度時就可表現(xiàn)出明顯差異，表明微量波動法相對于平板滲入法在進(jìn)行卷煙安全性評價中具有靈敏度高的特點。

通過平板滲入法和微量波動法的測定，1號煙（B2F）和2號煙（X3F）烤煙的致突變性存在顯著差異，1號（B2F）烤煙的致突變性明顯大于2號（X3F）烤煙。實驗表明通過合理的選擇葉組配方，能夠在一定程度上降低卷煙產(chǎn)品的致突變性，提高卷煙產(chǎn)品的安全性。對于采用同一葉組配方的卷煙產(chǎn)品，某一種添加劑添加量的不同也會造成其致突變性的差異，合理的選擇煙用添加劑及其用量對于降低卷煙產(chǎn)品的危害性具有一定意義。

[1]Ames BN，Mccann J，Yamasaki E.Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-micro some mutagenicity test[J].Mutat Res，1975，31（6）：64-347.

[2]Josephy P D，Gruz P，Nohmi T.Recent advances in the construction of bacterial genotoxicity assays[J].Mutation Research，1997，386：1-23.

[3]Hutton J J，Hackney C.Metabolism of cigarette smoke condensates by human and rat homogenates to form mutagens detectable by Salmonella typhimurium TA1538[J].Cencar Res，1975，35（9）：2461-2468.

[4]Kier L D，Yamasaki E，Ames B N.Detection of mutagenic activity in cigarette smoke condensates[J].Proc Natl Acad Sci USA.，1974 ，71（10）：4159-4163.

[5]盧斌斌，姚瑋華.卷煙煙氣體外毒理學(xué)測定方法研究進(jìn)展[J].中國煙草學(xué)報，2008，（4）：56-61.

[6]Green M H，Muriel W J，Bridges B A.Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens[J].Mutat Res，1976，38（1）：33-42.

[7]Falck K，Sorsa M，Vainio H，et al.Mutagenicity in urine of workers in rubber industry[J].Mutat Res，1980，79（1）：45-52.

[8]Kuhnlein U，Bergstrom D，Kuhnlein H.Mutagens in feces from vegetarians and non-vegetarians[J].Mutat Res，1981，85（1）：1-12.

[9]Levin DE，Blunt EL，Levin RE.Modified fluctuation test for the direct detection of mutagens in foods with Salmonella typhimurium TA98[J].Mutat Res，1981，85（5）：309-321.

[10]和智君，李紹臣，陳章玉.遺傳毒理學(xué)在低危害卷煙研究中的應(yīng)用綜述[J].煙草科技，2004，（10）：24-26.

[11]趙同剛.化妝品衛(wèi)生規(guī)范 [M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2007.

[12]宋 芬，李 彤，徐品良，等.微量波動試驗方法的研究[J].中國公共衛(wèi)生學(xué)報，1990，（39）：39-40.

[13]胡長燈，詹卓玲.微量波動試驗的影響因素及靈敏度研究[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1990，（4）：115-116，121.

[14]D Gatehouse，D J Wedd.The differential mutagenicity of isoniazid in fluctuation assays and Salmonella plate tests[J].Cardnogenesis，1984，（5）：391-397.

[15]GB15193.4-2003鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗[S].