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    大孔樹脂純化柿葉總黃酮的工藝研究

    2010-07-09 13:00:10董江濤徐慧強蔣橙華
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年11期
    關(guān)鍵詞:柿葉大孔蘆丁

    董江濤,李 燕,徐慧強,蔣橙華

    (上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

    柿葉中含有黃酮、Vc、β-胡蘿卜素、生物態(tài)堿和必需氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì),其中黃酮類化合物是主要的活性成分之一,具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝等作用[1],在防治中老年人腦動脈硬化、預(yù)防腦血栓形成、腦中風(fēng)后遺癥康復(fù)治療中有輔助作用,在皮膚抗衰老美容等方面也有廣泛開發(fā)應(yīng)用前景[2]。柿葉黃酮類化合物開發(fā)意義重大,但現(xiàn)有的提取方法所得黃酮純度一直不高,因此需要選擇一種較為經(jīng)濟快速的方式提高黃酮的純度。

    大孔樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物吸附劑,依靠其表面基團與待分離物質(zhì)的作用力不同進行吸附與洗脫。其物理化學(xué)性能穩(wěn)定、吸附選擇性好、富集效果好、不受無機物存在的影響、解吸條件溫和、使用周期長、再生簡便、節(jié)省費用等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化[3]。本試驗通過對10個不同型號的大孔樹脂對比,選取NKA-2樹脂作為純化柿葉黃酮的樹脂,并對其純化參數(shù)進行了優(yōu)化。

    1 材料

    1.1 材料與試劑

    柿葉:柿樹科(Ebenaceae)柿樹屬(Persimmonl)柿樹,樹齡三年。11月霜后采集河北大磨盤柿樹樹葉,經(jīng)60℃恒溫烘箱烘干備用。

    樹脂:D101型、HPD-826型、HPD-722型、HPD-600型、DM-130型、NKA-9型ADS-17型、ADS-7型(滄州寶恩化工有限公司);NKA-2型、AB-8型(上海華震科技有限公司);蘆丁標準品由中國藥品生物制品檢定所提供;NaNO2、Al(NO3)3、NaOH均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    2.0 cm×60 cm層析柱(上海錦華層析設(shè)備廠);HL-2恒流泵(上海青浦滬西儀器廠);WFZUV2000紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司);sartorius BS210S電子天平(北京塞多利斯天平有限公司);高速冷凍離心機(H2050R-1長沙湘儀離心機儀器有限公司);微量移液槍(德國eppendorf公司)。

    2 試驗方法

    2.1 樹脂的選擇

    大孔樹脂主要是通過其表面的基團與待分離物質(zhì)的結(jié)合力不同來實現(xiàn)物質(zhì)分離的,結(jié)合力強弱與基團的極性有關(guān)。根據(jù)黃酮類化合物的極性,選取了具有極性、弱極性、和非極性的10個大孔樹脂進行篩選,表1為10個型號大孔樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)。

    表1 10個型號大孔樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)

    2.2 樹脂的預(yù)處理

    經(jīng)篩選后的各樹脂,先用95%乙醇浸泡,于120次/min的搖床內(nèi)震蕩24 h充分溶脹,然后加入去離子水洗至洗出液無白色渾濁;用4倍體積的5%HCl溶液浸泡,于120次/min的搖床內(nèi)震蕩12 h,而后用去離子水速洗至出水pH值為中性;再用4倍體積的5%NaOH溶液浸泡,于120次/min的搖床內(nèi)震蕩12 h,用去離子水洗至pH值中性,濾去水后,于室溫晾干即得[3-4]。

    2.3 蘆丁標準曲線制作

    準確稱取0.010 0 g蘆丁標準品,用60%的乙醇溶解,定容到50 mL容量瓶中,搖勻,得0.200 mg/mL的蘆丁標準液。分別移取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL的蘆丁標準液于8個25 mL容量瓶中,各加1.0 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻后靜置6 min。再各加1.0 mL 10%的Al(NO3)3溶液,搖勻后靜置6 min。繼續(xù)各加入10.0 mL 4%的NaOH溶液,用60%的乙醇稀釋到刻度,靜置15 min。在510 nm處測定吸光度(A),以濃度(mg/mL)為橫坐標,A 為縱坐標制作標準曲線[5]。

    2.4 黃酮溶液配制

    將黃酮提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥,得到粗黃酮粉末,取1 g粉末溶解在50 mL 60%的乙醇中,量取0.2 mL,測定黃酮含量,經(jīng)計算得提取粗粉中黃酮含量為18.7%。根據(jù)含量按1∶93.5(g/mL)的比例,配置濃度為2.0 mg/mL的黃酮溶液。

    2.5 黃酮含量測定原理及方法

    2.5.1 黃酮含量測定原理 黃酮含量測定采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法,其原理是先用亞硝酸鈉還原黃酮,再加硝酸鋁絡(luò)合生成穩(wěn)定的紅橙色化合物,然后以蘆丁作標準,于510 nm(符合定量分析的比爾定律)波長處測定吸光度,計算黃酮類物質(zhì)的含量。

    2.5.2 黃酮含量測定方法 準確量取黃酮溶液1 mL于容量瓶中,加1.0 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻后放置6 min;再加入1.0 mL 10%的Al(NO3)3溶液,搖勻后放置6 min;繼續(xù)加入10.0 mL 4%的NaOH溶液,用60%的乙醇稀釋到刻度,放置15 min。在510 nm處測定吸光度,根據(jù)標準曲線計算黃酮含量[6]。

    2.6 10個型號樹脂對柿葉黃酮的吸附率與解吸率的測定

    2.6.1 吸附率測定 將選擇的10個不同極性的大孔樹脂進行吸附率的測定比較。測定方法為:準確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂各1 g于50 mL具塞磨口三角瓶中,加入柿葉總黃酮溶液25 mL(黃酮濃度為2.0 mg/mL),置搖床上振蕩24 h,振蕩頻率為220次/min,充分吸附后過濾,測定濾液中剩余黃酮濃度,按下式計算各樹脂的吸附率式中:Q—吸附率(mg/g),C0—初始濃度(mg/mL),Cr—剩余濃度(mg/mL),V—溶液體積(mL),W—樹脂的質(zhì)量(g)[7]。

    2.6.2 解吸率測定 取經(jīng)上述方法充分吸附黃酮后的樹脂各1 g,準確加入70%的乙醇30 mL,置搖床上振蕩12 h,振蕩頻率為120次/min,過濾,測定濾液中黃酮濃度,根據(jù)黃酮解吸量計算解吸率(%)。

    2.7 樹脂純化參數(shù)的優(yōu)化

    對2.6.2選取的樹脂的純化參數(shù)工藝進行優(yōu)化,分為靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附兩部分試驗。靜態(tài)吸附試驗主要考察上樣液pH值、吸附時間、解吸乙醇的濃度的影響。動態(tài)吸附試驗主要從上樣濃度、上樣流速、上樣量、洗脫流速、洗脫終點等方面進行考察。當流出液吸光度達上樣液的1/10時,認為達到穿透點停止上樣,計算吸附量。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 10個不同型號樹脂對柿葉黃酮的吸附率與解吸率

    如表2所示:吸附率較高的樹脂有:ADS-7、NKA-2、HPD-826,解吸率較高樹脂有:DM-130、HPD-600、NKA-2、HPD-826。綜合比較吸附率與解吸率選取NKA-2作為純化黃酮的較理想樹脂。

    表2 10個型號大孔樹脂對黃酮類化合物的吸附率與解吸率

    3.2 蘆丁標準曲線

    從圖1中可以看出,蘆丁標準曲線回歸方程為:A=9.412 2C-0.005 4(R2=0.999 7),其中C為黃酮濃度(mg/mL),A為吸光度,線性關(guān)系良好。

    圖1 蘆丁標準曲線圖

    3.3 NKA-2樹脂的靜態(tài)吸附試驗

    3.3.1 上樣液pH值的考察 分別考察了pH值為2、3、4、5、6 條件下黃酮的吸附率。結(jié)果(見圖 2)可知,當溶液的pH值為3時,黃酮的吸附率最高,吸附率隨著pH值繼續(xù)增加而降低。這是因為在酸性較強時易形成“佯鹽”,偏堿性時分子中酚羥基H+易失去,形成離子結(jié)構(gòu),不易被吸附[8]。

    3.3.2 吸附時間的考察 分別考察了1、2、3、4、5、6、8、10、12 h 后黃酮的吸附率,結(jié)果(見圖 3)中得知:吸附率在前3小時內(nèi)增長較快,到達第5小時樹脂基本達到吸附平衡。這是因為在吸附的最初階段,樹脂表面與黃酮接觸充分,但隨著吸附時間的繼續(xù)延長,由于孔容的極限,吸附量的增加速率減小。

    圖2 pH值對吸附率的影響

    圖3 吸附時間對吸附率的影響

    3.3.3 乙醇解吸濃度 分別以濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇,進行解吸,測定解吸液濃度計算解吸率,從結(jié)果(圖4)可看出隨著乙醇濃度的不斷增加,黃酮的解吸率不斷上升,這是由于柿葉中黃酮類化合物的極性決定的。當乙醇濃度達到70%后,解吸率增加不明顯,從節(jié)省原料的角度考慮,選取70%作為解吸乙醇的濃度。

    圖4 乙醇濃度對解吸率的影響

    3.4 NKA-2樹脂的動態(tài)吸附試驗

    3.4.1 上樣液濃度的考察 分別以濃度為4、6、8、10 mg/mL的黃酮溶液上樣,計算黃酮的吸附率,從結(jié)果(圖5)可知:隨著上樣液濃度的增加,黃酮的吸附率不斷降低,這是由于在較低的濃度下,黃酮與樹脂能夠充分接觸,吸收較強。大孔吸附樹脂的吸附量一般與上樣液濃度成反比,在低濃度下對吸附有利。在相同流速和相同吸附時間下,若上柱液濃度過大,由于孔容的限制,存在一個吸附極限,所以會有更多的有效物質(zhì)未被充分吸附而流出。

    圖5 上樣液濃度對吸附率的影響

    3.4.2 上樣量的考察 分別以 1、2、3、4、5、6、7、8 BV的量上樣,檢測上樣后流出液的黃酮濃度,計算NKA-2樹脂的吸附率,結(jié)果(圖6)可知:在上樣量較小的情況下,樹脂對黃酮的吸附基本與上樣量成正比,這是由于起始階段樹脂表面有足夠的基團吸附黃酮,隨著上樣量的不斷增大,樹脂表面基團不斷飽和,吸附能力逐漸減弱,表現(xiàn)為流出液的濃度升高,當C’/C=1/10時即達到吸附穿透點,認為吸附飽和,因此選擇5 BV作為上樣體積。

    圖6 上樣量的考察

    圖7 上樣流速對解吸率的影響

    3.4.3 上樣流速的考察 分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速通過NKA-2樹脂柱,計算樹脂對黃酮的吸附率,結(jié)果(圖7)可知:隨著上樣液流速的增加,黃酮的吸附率不斷降低,上柱液流速主要影響溶質(zhì)向樹脂表面擴散,從而決定了吸附效果。如果吸附流速過大,會使樹脂的吸附量下降。因為在相同的吸附速度下,加快流速使得相對吸附時間減少,溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂內(nèi)表面,未被充分吸附就流出來了,造成樣品的流失;如果流速過小,試驗周期延長,效率降低??紤]到吸附效果與試驗周期的要求,以2 BV/h作為上樣流速。

    3.4.4 洗脫速度的考察 分別以 1、2、3、4、5 BV/h的流速進行洗脫,收集洗脫液檢測黃酮含量,計算總黃酮的解吸率,結(jié)果(圖 8)可看出,以1、2 BV/h的流速洗脫時,黃酮回收率相近,更高的流速并沒有將黃酮充分解吸,這是由于較低流速下乙醇能夠充分溶解已吸附的黃酮,而過高的流速使得乙醇沒能來得及溶解黃酮就已經(jīng)流走。因此結(jié)合試驗周期的需求,以2 BV/h的流速進行洗脫較優(yōu)。

    圖8 洗脫流速對吸附率的影響

    3.4.5 洗脫終點的考察 取柿葉樣品液(總黃酮含量為4.0 mg/mL),調(diào)節(jié) pH=3,以2 BV/h的流速、5 BV的上樣量加入 NKA-2樹脂柱,進行吸附,再以5 BV水洗脫后,用70%乙醇以2 BV/h的速度洗脫,按樹脂床體積收集洗脫液,計算含量,結(jié)果(圖9)可看出,在起始階段,隨著乙醇體積的增大,黃酮的解吸率增加很快,當洗脫液用量為6 BV時,解吸率增加緩慢,通過計算得知基本達到解吸平衡,因此選定6 BV作為洗脫體積。

    圖9 洗脫終點的考察

    3.5 分離的柿葉總黃酮純度考察

    取柿葉樣品液(總黃酮含量為2.0 mg/mL)20 mL平行3份,調(diào)節(jié)pH=3,以BV/h的上樣流速通過NKA-2樹脂柱(2 cm×20 cm),上樣體積為5 BV,以2 BV/h的洗脫流速用70%的乙醇洗脫,收集洗脫液,取10 mL,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,冷凍干燥,測定總黃酮的含量,經(jīng)計算總黃酮的純度分別為51.7%、52.2%、52.1%,平均為52%,測定結(jié)果穩(wěn)定,偏差不大,說明經(jīng)NKA-2大孔樹脂處理后的總黃酮含量可達50%以上,且具有良好的重現(xiàn)性。

    4 結(jié)論

    通過對大孔樹脂動態(tài)吸附及解吸的相關(guān)因素研究,確定了大孔樹脂分離柿葉總黃酮的最佳工藝:樹脂型號為NKA-2型大孔樹脂,上樣液濃度為4 mg/mL(溶液pH=3),吸附速率為2 BV/h時吸附效果最好,上柱量為5 BV,洗脫最佳工藝為:6 BV的70%乙醇,以2 BV/h的速率洗脫效果最佳。經(jīng)NKA-2處理后的柿葉總黃酮可達52%,與粗粉中黃酮含量比較,純化了33.8%。

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