乙型肝炎的肝臟免疫學(xué)和免疫治療

王福生

解放軍第三〇二醫(yī)院生物治療研究中心

乙型肝炎病毒（HBV）是一種DNA病毒（屬于嗜肝DNA病毒科），可引起急性肝炎、慢性肝炎，肝硬化和肝癌[1]。研究提示病毒本身、人體免疫系統(tǒng)和肝臟病理是影響疾病進展、臨床預(yù)后三大因素，其中機體抗HBV免疫學(xué)應(yīng)答的作用貫穿臨床發(fā)病和治療的始末[2]，這里，我們針對抗HBV免疫學(xué)應(yīng)答特點與抗病毒治療相關(guān)問題的關(guān)系，討論抗病毒治療存在的問題和不足，對于今后的深入研究和臨床優(yōu)化抗病毒治療方案具有重要意義。

1 急性HBV感染可產(chǎn)成保護性免疫應(yīng)答

在臨床上，急性自愈性乙肝和1%～2%的慢性乙肝患者能夠自發(fā)清除HBV，其中患者的免疫系統(tǒng)被HBV有效地激活，天然免疫和特異性免疫應(yīng)答協(xié)調(diào)一致，同時不同功能的免疫細胞各司其職、相互配合,才能有效的清除了病毒，不僅如此，他們還能夠建立起長期的免疫保護，代表性的免疫學(xué)指標就是產(chǎn)生保護性抗表面抗原抗體[1,3]。有意思的是，在乙肝病毒急性感染的窗口期還存在一個病毒的清除期，該清除期要早于病毒特異性T細胞的擴增，提示天然免疫細胞在此過程中發(fā)揮重要的作用[4]。值得注意的是，多克隆、多表位病毒特異性CD8最終承擔了清除病毒的任務(wù)[5]。然而，如果免疫反應(yīng)不協(xié)調(diào)，則造成病毒的慢性化或者引發(fā)患者致死性后果。我們的研究提示：在病毒急性感染的早期，如果PD-1分子在病毒特異性CTL不能及時的表達，那么患者很可能由于過激的免疫反應(yīng)導(dǎo)致死亡[5]。盡管這些研究提示HBV特異性CD8 T細胞是抗HBV不可或缺的組成成分，但由于缺乏合適的動物模型，造成針對乙肝病毒感染發(fā)病機制研究的重要障礙。

2 HBV慢性感染造成保護性免疫應(yīng)答功能損傷

在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)，機體免疫應(yīng)答和病毒的復(fù)制相互作用、彼消此長，共同決定了疾病的進程，其中，持續(xù)的HBV復(fù)制和宿主抗HBV免疫功能的低下是慢性乙肝的兩個重要特征，具體表現(xiàn)在大多數(shù)慢性乙肝患者存在持續(xù)性HBV復(fù)制，伴隨病毒特異性CD8 T細胞功能損傷、樹突狀細胞的功能缺陷、調(diào)節(jié)性T細胞增多、免疫抑制性途徑異?；钴S等[6-9]。同時肝組織中大量非特異性淋巴細胞浸潤，導(dǎo)致肝臟組織炎癥和肝細胞壞死[10]。臨床上具體表現(xiàn)為（1）當病毒復(fù)制能力顯著高于機體的免疫清除能力時，臨床上表現(xiàn)為病毒載量的持續(xù)上升；（2）當病毒復(fù)制能力與機體清除病毒的能力大致相同時，機體的病毒載量處于穩(wěn)定的、相對不變的水平；（3）當機體對病毒的免疫清除能力顯著高于病毒復(fù)制能力時，臨床上表現(xiàn)為病毒載量持續(xù)下降。顯然，在上述第一和第二種情況下，病毒復(fù)制持續(xù)地誘導(dǎo)著機體的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致肝臟發(fā)生不同程度的炎癥和肝細胞壞死，甚至發(fā)生肝纖維化等病理改變；而在第三種情況下，機體的免疫應(yīng)答有效控制病毒復(fù)制后，肝臟的炎癥和壞死才得到緩解。因此，只有使機體產(chǎn)生了有效的抗病毒免疫應(yīng)答，才能真正達到臨床完全控制病毒復(fù)制甚至清除病毒的目的。

3 抗病毒治療過程中三個階段的變化與免疫學(xué)應(yīng)答關(guān)系

理想的抗病毒治療結(jié)果是，慢性乙肝患者通常經(jīng)歷三個階段的重要變化：（1）病毒載量降低到檢測水平之下，血清ALT恢復(fù)到正常水平；（2）發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換；（3）發(fā)生HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[11]。臨床上對抗病毒治療產(chǎn)生完全應(yīng)答的患者，至少表現(xiàn)為HBeAg血清轉(zhuǎn)換?？梢哉J為第一階段變化主要是通過抗病毒的藥物來實現(xiàn)的；而第2和第3階段的變化，除了抗病毒藥物繼續(xù)發(fā)揮抑制病毒復(fù)制之外，機體的免疫應(yīng)答（包括細胞和體液免疫）承擔了進一步清除病毒抗原（HBeAg和HBsAg）和cccDNA的重任。例如：初次接受藥物抗病毒的慢性乙肝患者，通常表現(xiàn)為能夠有效抑制病毒的復(fù)制，減輕肝臟的炎癥和壞死，進而使肝臟的功能得到恢復(fù)。在這一過程中，由于病毒的復(fù)制被抑制，阻斷了病毒的產(chǎn)生和來源，同時體內(nèi)已有的病毒被宿主免疫系統(tǒng)不斷地清除，盡管會導(dǎo)致肝臟發(fā)生暫時的炎癥和肝細胞壞死，但隨著患者體內(nèi)病毒載量的不斷下降直至檢測不到，肝臟炎癥和壞死得到恢復(fù)。其中無論是血清HBeAg（+），還是HBeAg（-）的慢性乙型肝炎患者，只要伴隨高ALT水平往往預(yù)示著發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換的可能性較大，這是因為ALT水平高時，機體也相對具有較強的抗HBV免疫應(yīng)答能力。此外，能夠出現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)換的患者通常有很好的免疫功能恢復(fù)。因此抗病毒藥物可以通過抑制病毒的復(fù)制而發(fā)揮始動牽引作用，肝臟功能和損傷的恢復(fù)是治療的根本，但有效的抗病毒治療始終離不開機體免疫系統(tǒng)自身功能的恢復(fù)和對病毒有效地清除。這些都提示抗HBV免疫反應(yīng)恢復(fù)將有助于提高臨床的抗病毒療效，因此適當開展免疫調(diào)節(jié)治療將有助于患者加快實現(xiàn)第2和第3階段的變化，擔當起實現(xiàn)最終徹底清除HBV的重任。

4 廣義和狹義抗病毒治療概念提示免疫治療的重要性

核苷類似物盡管廣泛應(yīng)用于臨床抗病毒治療，但由于它治療周期長，無明確的停藥指征，雖然目前有些藥物可以HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換作為停藥指征，但范圍太窄，一旦隨意停藥，極易引起復(fù)發(fā)。而用干擾素治療則HBsAg清除率較高，HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換相對常見，為什么會出現(xiàn)這樣的情況呢？讓我們先從HBV的生活周期看起。

HBV感染肝細胞后進入胞漿，隨后HBV DNA進入細胞核，轉(zhuǎn)化為cccDNA（病毒庫），以cccDNA模板轉(zhuǎn)錄出前基因組RNA（pgRNA），pgRNA一方面以其為模板合成病毒蛋白，另一方面參與核心顆粒組裝，部分核心顆粒循環(huán)回核，增加cccDNA的貯備，另一部分在高爾基體內(nèi)進一步裝配成完整的病毒顆粒分泌出肝細胞。在此過程中，HBV DNA聚合酶作用于pgRNA，使之逆轉(zhuǎn)錄為負鏈DNA，然后再以負鏈DNA為模板合成部分正鏈DNA（見圖1）[12]。

圖1 HBV生活周期及HBV DNA聚合酶的作用位點

從上述HBV復(fù)制過程可以看出，在HBV復(fù)制過程中有兩個很重要的因素，一個是HBV DNA聚合酶，另一個是模板。沒有這兩個因素，乙肝病毒就不能復(fù)制。HBV DNA聚合酶的作用就是“催化”乙肝病毒基因的復(fù)制，目前臨床上使用的核苷類似物（NA）的作用靶點均是HBV DNA聚合酶，能夠較強地抑制HBV DNA的復(fù)制，但不直接作用于蛋白質(zhì)翻譯過程，僅僅是通過減少合成病毒抗原的模板――mRNA來降低抗原表達，所以臨床表現(xiàn)即降低HBV DNA常常比較迅速，且病毒DNA陰轉(zhuǎn)率很高，但HBeAg和HBsAg陰轉(zhuǎn)率不明顯，且須長期治療。干擾素雖然有直接抗病毒作用和部分免疫調(diào)節(jié)作用，但其副作用大，適應(yīng)證有嚴格要求，而且不能對病毒生活周期的每個環(huán)節(jié)發(fā)揮抑制作用。綜合分析以上抗病毒藥物存在種種不足，我們認為目前的抗病毒治療只是一個“狹義”的抗病毒治療，僅僅抑制病毒的復(fù)制，而無法清除病毒抗原和HBV cccDNA。

圖2 針對HBV的生活周期，提出“狹義”和“廣義”抗病毒治療的概念

圖3 抗病毒聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療的“爬坡假說”

因而，我們在設(shè)計新的抗HBV策略時，應(yīng)該研制能清除HBV cccDNA的新的抗HBV藥物和療法?；趯BV復(fù)制周期和慢性乙肝發(fā)病機制的認識，要想最終達到清除cccDNA，唯有通過恢復(fù)和提高機體的天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，特別是特異性CD8 T細胞功能，特異性地破壞HBV感染細胞，使殘留于肝細胞內(nèi)的HBV cccDNA降解，只有通過這種“廣義”的抗病毒治療，才能達到徹底根治HBV感染的目的（圖2）。

基于對慢性乙肝“狹義”和“廣義”抗病毒治療的理解，我們開展了自體CIK細胞免疫治療慢性乙肝的臨床應(yīng)用研究，發(fā)現(xiàn)利用CIK細胞進行免疫調(diào)節(jié)治療，對抑制HBV的復(fù)制，恢復(fù)損傷的肝細胞具有一定的作用，目前我們不但明確了CIK細胞治療慢性乙肝的療效和適應(yīng)證，而且制定了臨床治療方案[13-14]。

5 爬坡假說

由于核苷類似物長期抗病毒治療和固定療程的長效干擾素治療，都難以達到徹底清除病毒的目的，而且不管是采用短程單用藥物還是聯(lián)合用藥的抗病毒治療方案，結(jié)果都顯示療效之間沒有明顯的差別，原因可能是沒有很好地跨越機體免疫功能低下的“門檻”（同時還可能包括耐藥等病毒學(xué)因素的影響）。臨床上“免疫耐受期”的慢性乙肝患者（通常表現(xiàn)為：ALT＜2×ULN，HBeAg陽性，HBV DNA＞105拷貝/ml，肝活檢未見中重度炎癥），由于持續(xù)病毒高水平復(fù)制，逐漸的積累或者加重患者抗HBV免疫反應(yīng)損傷的程度，甚至導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)全面的功能損傷，即使他們接受抗病毒（包括藥物和免疫調(diào)節(jié)兩個方面）治療，療效往往較差，表現(xiàn)為應(yīng)答率很低或者需要進行治療的時間和出現(xiàn)病毒學(xué)、免疫學(xué)和組織學(xué)應(yīng)答的時間都可能顯著延長。所有這些與機體本身缺乏有效的抗HBV免疫應(yīng)答密切相關(guān)。

我們認為在慢性乙肝抗病毒治療的過程中，應(yīng)該最大限度地發(fā)揮藥物（核苷類似物和干擾素）抑制病毒復(fù)制的能力、同時提高機體免疫清除病毒的能力，再加上緩解和停止肝臟的病理變化，延緩和阻斷疾病向肝硬化、肝癌方向發(fā)展。根據(jù)目前的研究結(jié)果和臨床觀察到的現(xiàn)象，我們近來提出“爬坡假說”[2,15]。后者顯示慢性乙肝的抗病毒治療需要跨越三大“門檻”才有可能使患者恢復(fù)到健康狀態(tài)，獲得理想的治療效果。這三大“門檻”是：（1）病毒活躍和持續(xù)復(fù)制、（2）機體抗HBV免疫應(yīng)答低下、（3）肝臟病理學(xué)（炎癥、壞死，甚至發(fā)生纖維化等）改變（見圖3）。相對應(yīng)的可能是開展三個方面的治療：即抗病毒治療（最好包括抑制HBV復(fù)制和抗原合成兩個方面）、保護肝臟治療（阻斷肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化的進程等）和免疫調(diào)節(jié)治療。根據(jù)上述的“爬坡假說”，我們初步認為：首先，借助抗病毒藥物,在控制病毒復(fù)制的同時，為機體免疫功能的恢復(fù)實施“減壓”。其次，在藥物抗病毒和保肝治療的基礎(chǔ)上，實施免疫調(diào)節(jié)治療（最好以增強抗HBV特異性細胞和體液免疫應(yīng)答為主），幫助患者發(fā)生HBeAg和HBsAg血清轉(zhuǎn)換，充分恢復(fù)患者抗病毒的免疫應(yīng)答，并獲得穩(wěn)定的臨床療效，達到“建立斜坡、克服鴻溝”的目的（見圖3）。

[1]Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection[J].Nat Rev Immunol., 2005, 5(3): 215-29.

[2]Wang FS, Zhang Z. Host immunity infuences disease progression and antiviral effcacy in humans infected with hepatitis B virus[J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol., 2009, 3(5):499-512.

[3]Wang FS. Clinical immune characterization of hepatitis B virus infection and implications for immune intervention: progress and challenges[J].Hepatol Res., 2007; 37 (Suppl 3): S339-46.

[4]Webster G, Reignat S, Maini M, et al. Incubation phase of acute Hepatitis B in man: dynamic of cellular immune mechanism[J].Hepatology, 2000, 32(5): 1117-24.

[5]Zhang Z, Zhang JY, Wherry EJ, et al. Dynamic programmed death 1 expression by virus-specific CD8 T cells correlates with the outcome of acute hepatitis B[J]. Gastroenterology, 2008, 134(7): 1938-49.

[6]Dunn C, Brunetto M, Reynolds G, et al. Cytokines induced during chronic hepatitis B virus infection promote a pathway for NK cellmediated liver damage[J]. J Exp Med., 2007, 204(3): 667-80.

[7]Zhang Z, Chen D, Yao J, et al. Increased infiltration of intrahepatic DC subsets closely correlate with viral control and liver injury in immune active pediatric patients with chronic hepatitis B[J]. Clin Immunol.,2007, 122(2): 173-80.

[8]Zhang Z, Zou ZS, Fu JL, et al. Severe dendritic cell perturbation is actively involved in the pathogenesis of acute-on-chronic hepatitis B liver failure[J]. J Hepatol., 2008, 49(3): 396-406.

[9]Xu D, Fu J, Jin L, et al. Circulating and liver resident CD4+CD25+regulatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease progression in patients with hepatitis B[J]. J Immunol., 2006,177: 739-47.

[10]Zhang JY, Zhang Z, Lin F, et al. Interleukin-17-producing CD4+ T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B[J]. Hepatology, 2010, 51(1): 81-91.

[11]Lok AS, McMahon BJ. Chronic hepatitis B: AASLD practice guideline[J]. Hepatology, 2007, 45(2): 507-39.

[12]Seeger C, Mason WS. Hepatitis B Virus Biology[J]. Microbiol Mol Biol Rev. 2000, 64(1): 51-68.

[13]Shi M, Fu J, Shi F, et al. Transfusion of autologous cytokine-induced killer cells inhibits viral replication in patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Clin Immunol., 2009, 132(1): 43-54.

[14]Shi M, Fu J, Shi F, et al. Viral suppression correlates with dendritic cell restoration in chronic hepatitis B patients with autologous cytokineinduced killer cell transfusion[J]. Liver Int, 2009, 29(3): 466-74.

[15]王福生, 張紀元. 將慢性乙型肝炎抗病毒治療進行到底?—關(guān)于影響療效和預(yù)后的機體免疫學(xué)因素[J]. 中華肝臟病雜志, 2009, 17(3):164-6.

王福生，男，1962年生，安徽人。醫(yī)學(xué)博士、教授、博士生導(dǎo)師。

現(xiàn)任中國人民解放軍傳染病研究所所長；解放軍第三〇二醫(yī)院肝病免疫治療中心主任。國家杰出青年基金獲得者、國家科技部973項目首席科學(xué)家、中國免疫學(xué)會感染免疫分會主任委員、北京免疫學(xué)會副理事長、國家衛(wèi)生部艾滋病臨床專家委員會委員、中國科學(xué)院生物物理研究所感染免疫中心副主任、博士生導(dǎo)師；北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部博士生導(dǎo)師；獲得國務(wù)院（專家）特殊津貼；分別擔任中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)療事故鑒定專家、中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)會委員等學(xué)術(shù)兼職。擔任Clinical Immunology、PLoS ONE、 Hepatology International、《中華醫(yī)學(xué)雜志》、《中華肝臟病學(xué)雜志》、《肝臟》、《中華臨床感染病雜志》等十余家雜志的編委、《傳染病信息》雜志副主編。

主要研究方向為病毒性肝炎和艾滋病的臨床免疫學(xué)發(fā)病機制和免疫治療。已經(jīng)建立了聯(lián)合抗病毒性肝炎抗病毒的免疫細胞治療的新型方案。近年來多次參與病人會診。應(yīng)邀參加國、內(nèi)外病毒性肝炎和生命科學(xué)領(lǐng)域大會，并作特邀學(xué)術(shù)報告80多次。

曾獲國家科技進步二等獎1項；省部級科技成果二等獎4項。發(fā)表科學(xué)論文二百余篇，包括以通訊作者發(fā)表在 Gastroenterology、Blood、J Immunol、J Hepatol、N Engl J Med、Emerg Infect Dise等SCI論文48篇。

王英杰，男，陜西延安市人。醫(yī)學(xué)博士，教授、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師。

1985年畢業(yè)于延安大學(xué)醫(yī)學(xué)系（本科），1992年和1997年在第三軍醫(yī)大學(xué)獲內(nèi)科學(xué)（傳染病學(xué)）碩士和博士學(xué)位，2005～2007年赴美國高訪研究?，F(xiàn)擔任第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染病分院副院長。為首屆全國百名優(yōu)秀博士論文獲得者，被評為解放軍總后勤部科技新星、首屆重慶市有突出貢獻的中青年專家，享受政府特殊津貼。

現(xiàn)任中華醫(yī)學(xué)會肝臟病分會重型肝炎與人工肝學(xué)組委員、全國人工肝與血液凈化協(xié)作攻關(guān)組委員，《肝臟》、《實用肝臟病雜志》、《胃腸病學(xué)與肝病學(xué)雜志》等雜志的編委。主編專著2部，發(fā)表論文150多篇，獲國家科技進步二等獎1項、軍隊和重慶市科技進步一、二等獎3項，獲得國家發(fā)明專利與實用新型專利8項。