微流控芯片在表面等離子體共振生物傳感器中的應(yīng)用

駱亦奇

(斯坦福大學(xué)化學(xué)系 美國加利福尼亞94305)

今日化學(xué)

微流控芯片在表面等離子體共振生物傳感器中的應(yīng)用

駱亦奇

(斯坦福大學(xué)化學(xué)系 美國加利福尼亞94305)

作為眾所周知的生物傳感器技術(shù)，表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)正在被越來越普遍地用于實(shí)現(xiàn)各種生物化學(xué)檢測方法，特別是用途廣泛的固相表面生物檢測(Solid－Phase Bioassay)。SPR對樣品進(jìn)行非標(biāo)記檢測，能夠用于測量生物化學(xué)反應(yīng)全過程的反應(yīng)動力學(xué)。為了提高SPR的檢測效率，通常將微流控技術(shù)(Microfluidics)與SPR相結(jié)合，即在SPR生物傳感器中使用微流控芯片(Microfluidic Chip)作為反應(yīng)裝置?；谖⑿突瘞淼膬?yōu)勢，使用微流控芯片作為反應(yīng)裝置可以有效地縮短生物化學(xué)檢測方法的反應(yīng)時間，并減少樣品消耗。微流控芯片還可以平行排布相同的結(jié)構(gòu)單元，提高SPR生物傳感器的檢測通量。因此，使用微流控芯片作為反應(yīng)裝置是SPR生物傳感器，特別是商品化的SPR生物傳感器的發(fā)展趨勢。

1 表面等離子體共振生物傳感器

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是當(dāng)今應(yīng)用最普遍的非標(biāo)記光學(xué)生物傳感器(Label－Free Optical Biosensor)技術(shù)，在生物和化學(xué)工業(yè)特別是制藥工業(yè)中有很廣泛的應(yīng)用。SPR不需要對被測物進(jìn)行標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)使其可以測量生物活性分子在無修飾條件下的反應(yīng)動力學(xué)。因此，SPR適用于高通量生物活性分子特別是小分子的篩選，微量未知物的分析，以及在線樣品檢測。由于其廣泛的應(yīng)用價值，SPR生物傳感器(SPR Biosensor)的商品化已有近20年的歷史［1－3］。

SPR的工作原理是基于入射光激發(fā)的金屬/電介質(zhì)界面的電子集團(tuán)性共振現(xiàn)象。SPR生物傳感器中的電介質(zhì)通常是含有生物活性分子的溶液。金(Au)是最普遍使用的金屬材料，這不僅是因?yàn)榻鹁哂羞m合于SPR用途的物理性質(zhì)，也由于金具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)且易于進(jìn)行表面功能化。金的表面可以通過自組裝膜方法或者吸附方法固定生物活性分子，實(shí)現(xiàn)SPR生物傳感器的生物分子識別和捕捉功能。在SPR生物傳感器的測量裝置中，p型偏振入射光被高折射率棱鏡(Prism)耦合到金屬膜(Metal Film)與溶液的界面上，入射光的能量在金屬/溶液界面上被金屬自由電子組成的等離子體(Plasmon)吸收。高折射率棱鏡的作用是調(diào)節(jié)入射光的動量以達(dá)到與金屬/溶液界面的模式匹配，使入射光能夠共振激發(fā)金屬自由電子的集團(tuán)性震蕩。等離子體的能量沿著金屬/溶液界面向附近傳播，以熱能的形式消散，所以反射光的能量小于入射光的能量。在垂直于金屬/溶液界面的方向上，等離子體的能量以消逝波(Evanescent Wave)的形式存在，通常這個消逝波的衰減距離在500nm以內(nèi)。由于入射光和金屬/溶液界面的耦合條件與消逝波范圍內(nèi)的溶液的折射率密切相關(guān)，可以用SPR測量金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)的折射率。在實(shí)際應(yīng)用中，通常用改變?nèi)肷涔饨嵌鹊姆椒▉砀淖兊竭_(dá)金屬/溶液界面的入射光動量。當(dāng)入射光角度達(dá)到共振角時，入射光與等離子體達(dá)到最佳耦合條件，金屬自由電子與入射光產(chǎn)生共振能量傳遞，入射光的能量幾乎完全轉(zhuǎn)換成等離子體的能量，反射光的能量達(dá)到最低。SPR光譜圖就是反射光與入射光的相對強(qiáng)度(Reflectivity)對于入射光角度作圖得到的曲線，從曲線的最低點(diǎn)可以讀出共振角的數(shù)值。共振角的數(shù)值取決于金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)的折射率，通過記錄共振角隨時間的變化，可以實(shí)時測量該區(qū)域內(nèi)的折射率變化。對于SPR生物傳感器來說，折射率變化由金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)引起，是衡量反應(yīng)進(jìn)程和反應(yīng)動力學(xué)的有效指標(biāo)。因?yàn)樯锘瘜W(xué)反應(yīng)中的分子變化會引起反應(yīng)所在區(qū)域的折射率變化，所以SPR生物傳感器不要求對被檢測的分子進(jìn)行標(biāo)記，有效地簡化了樣品制備過程。

SPR的測量裝置可以通過兩種帶有棱鏡的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)，即按照棱鏡－溶液－金屬接觸順序的Otto結(jié)構(gòu)和按照棱鏡－金屬－溶液接觸順序的Kretschmann結(jié)構(gòu)。Otto結(jié)構(gòu)中的溶液層厚度很小，給測量裝置的制造增加了難度。因此，現(xiàn)在大部分SPR生物傳感器尤其是商品化的SPR生物傳感器的測量裝置采用較易實(shí)現(xiàn)的Kretschmann結(jié)構(gòu)。經(jīng)典的采用Kretschmann結(jié)構(gòu)的SPR生物傳感器的測量裝置如圖1所示。理想的SPR光譜圖如圖2所示，從圖2中SPR曲線的位置變化可以讀出金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)引起的SPR信號變化。在實(shí)時測量反應(yīng)進(jìn)程時，SPR信號既可以是共振角的變化，也可以是在固定的入射光角度下測量由于共振角變化引起的反射光與入射光的相對強(qiáng)度變化。在SPR生物傳感器的測量裝置中進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)，可以用SPR傳感器譜圖(Sensorgram)即SPR信號關(guān)于時間的圖譜來記錄。

圖1 采用K retschmann結(jié)構(gòu)的SPR生物傳感器的測量裝置

圖2 理想的SPR光譜圖

生物化學(xué)檢測方法中的固相表面生物檢測(Solid－Phase Bioassay)是SPR生物傳感器的主要應(yīng)用方向。固相表面生物檢測通過在固相表面上進(jìn)行配體物(Ligand)分子與分析物(Analyte)分子的相互作用(Interaction)來實(shí)現(xiàn)。通常情況下這種相互作用是可逆的，包含了配體物分子與分析物分子的結(jié)合反應(yīng)(Association)和解離反應(yīng)(Dissociation)。固定在固相表面上的配體物分子可以識別并且結(jié)合與之接觸的液相中的分析物分子，將液相中的分子有選擇性地富集到固相表面上(圖1)。同時，由于這種相互作用是可逆的，當(dāng)液相中的分析物分子數(shù)量下降時，在固相表面上已經(jīng)結(jié)合的配體物分子與分析物分子可以進(jìn)行解離反應(yīng)，使得分析物分子重新回到液相中。對于測量范圍在金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)的SPR來說，用于固相表面生物檢測可以有效地發(fā)揮其長處，特別是不需要對被檢測的分子進(jìn)行標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)。因此，自從SPR生物傳感器的概念提出以來，大部分SPR生物傳感器，特別是商品化的SPR生物傳感器用于實(shí)現(xiàn)固相表面生物檢測。在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的應(yīng)用中，SPR生物傳感器已經(jīng)可以通過固相表面生物檢測來測量各種生物活性分子之間的親和力，包括大分子與大分子之間的親和力以及大分子與小分子之間的親和力［4－7］。

在用于實(shí)現(xiàn)固相表面生物檢測時，SPR生物傳感器的測量裝置需要執(zhí)行3個主要反應(yīng)步驟:①將可以選擇性結(jié)合分析物分子的配體物分子固定在金屬膜表面上。② 將流動的分析物溶液與金屬膜表面接觸，使得配體物分子與分析物分子在金屬膜表面上進(jìn)行相互作用，包括結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)。分析物是SPR生物傳感器直接測量的物質(zhì)，在常規(guī)的固相表面生物檢測中，分析物溶液等同于樣品溶液，分析物就是樣品中的被測物。這個步驟可以稱為結(jié)合步驟。③將流動的空白反應(yīng)溶液(Running Buffer)與金屬膜表面接觸，使得在金屬膜表面上的配體物分子與分析物分子進(jìn)行解離反應(yīng)。這個步驟可以稱為解離步驟。在結(jié)合步驟中，開始時配體物分子與分析物分子只進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，隨著金屬膜表面上分析物分子數(shù)量增加，解離反應(yīng)開始進(jìn)行并且和結(jié)合反應(yīng)同時存在，在反應(yīng)時間充足的情況下，兩者的速率逐漸趨于相等，相互作用接近動態(tài)平衡狀態(tài)(Equilibrium)。在解離步驟中，由于空白反應(yīng)溶液中沒有分析物分子，理論上在解離反應(yīng)進(jìn)行的同時不會有結(jié)合反應(yīng)發(fā)生。因此通過解離步驟的結(jié)果可以準(zhǔn)確地得到解離反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，然后綜合結(jié)合步驟和解離步驟的結(jié)果可以得到結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。理想的固相表面生物檢測的SPR傳感器譜圖如圖3所示，SPR信號的上升階段顯示了配體物分子與分析物分子的結(jié)合步驟，下降階段顯示了隨后的解離步驟。SPR信號的變化幅度顯示了金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)總的分子數(shù)量變化，當(dāng)配體物分子與分析物分子的相互作用達(dá)到平衡狀態(tài)時，SPR信號的變化幅度可以用來計(jì)算分析物分子在樣品溶液中的濃度。在主要反應(yīng)步驟之外，測量裝置也需要執(zhí)行一些輔助反應(yīng)步驟，包括在固定配體物分子之前活化金屬膜表面和在固定配體物分子之后清洗金屬膜表面。由于主要反應(yīng)步驟所需的配體物、分析物和輔助反應(yīng)步驟所需的物質(zhì)以溶液的形式進(jìn)入SPR生物傳感器的測量裝置進(jìn)行各種反應(yīng)，這些溶液可以稱為用于固相表面生物檢測的反應(yīng)溶液。

SPR生物傳感器技術(shù)在快速發(fā)展中。隨著SPR測量方法的漸趨成熟，如何提高測量裝置的效率成為革新的關(guān)鍵。SPR生物傳感器的主要應(yīng)用方向是高通量快速檢測，微型化的測量裝置是提高檢測通量和速度的有效途徑，理由是:①通常SPR生物傳感器中的生物化學(xué)反應(yīng)在流動中的溶液和功能化的金屬膜表面上進(jìn)行，所以測量裝置的微型化可以提高傳質(zhì)效率，以此加快反應(yīng)速率，同時提高檢測速度［8－9］。②由于SPR的測量面積有限，測量裝置的微型化可以增加單位面積上的反應(yīng)器單元，提高SPR生物傳感器的檢測通量(Throughput)。③測量裝置的微型化減少了檢測所需的樣品量，可以減少對微量樣品的稀釋程度，間接地改進(jìn)SPR生物傳感器的最低檢測限(Limit of Detection)。所以，微型化的測量裝置符合SPR生物傳感器的要求并且從一開始就在其中應(yīng)用。近年來，微流控技術(shù)(Microfluidics)的迅速發(fā)展提供了制造復(fù)雜的微流控芯片(Microfluidic Chip)的方法，推動了應(yīng)用微流控芯片作為微型化的測量裝置的SPR生物傳感器的發(fā)展。

2 微流控技術(shù)和微流控芯片

微流控技術(shù)是研究設(shè)計(jì)制造微型化的實(shí)驗(yàn)裝置(微流控芯片)并將其應(yīng)用于以流體為載體的物理、化學(xué)、生物實(shí)驗(yàn)的學(xué)科。自從20世紀(jì)90年代初被提出以來，微流控技術(shù)已經(jīng)成功地將大量傳統(tǒng)的化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)工具實(shí)現(xiàn)在微流控芯片上［9－11］，例如高效液相色譜、生物活性材料合成、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、固相萃取、蛋白質(zhì)結(jié)晶、單分子光譜等。作為傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)工具實(shí)現(xiàn)微型化的平臺，微流控芯片顯示出了以下優(yōu)勢:高通量，快速，低樣品消耗，體積小，一次性使用，以及易于實(shí)現(xiàn)自動化。微流控芯片的優(yōu)勢來自于微型化和液體在小尺度情況下的物理性質(zhì)。微型化不僅縮小了實(shí)驗(yàn)裝置的體積，減少了樣品消耗，還拉近了各個功能單元的距離，便于將不同的實(shí)驗(yàn)工具在微流控芯片中連接起來實(shí)現(xiàn)自動化。同時，在微型通道里流動的液體，具有低Reynolds數(shù)流動的特點(diǎn)［12］。跟大尺度情況下相比，液體的流動受慣性力的影響下降，受黏滯力的影響上升。所以，液體在大部分微流控芯片中的流動類型屬于層流，具有穩(wěn)定的流場，可以較為準(zhǔn)確地進(jìn)行控制。

微流控芯片由一個或幾個可供液體流動的微型通道網(wǎng)絡(luò)(Microchannel Network)構(gòu)成。微流控芯片中的通道可以按照所具備的功能劃分為液體輸送管道，反應(yīng)器，控制器等結(jié)構(gòu)單元。反應(yīng)器是微流控芯片中實(shí)現(xiàn)各種反應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元，里面帶有功能化的表面或者參與反應(yīng)的物質(zhì)，例如用于SPR生物傳感器的微流控芯片中金屬膜所在的部分?？刂破靼刂屏黧w運(yùn)動的閥門和各種推動流體運(yùn)動的動力設(shè)備。微流控芯片中的閥門主要是微型薄膜閥［13］，動力部件包括微型蠕動泵(Peristaltic Pump)和電滲泵(Electroosmotic Pump)等［14］。

按照在垂直方向上的通道層數(shù)，可以把微流控芯片分為單層芯片和多層芯片。在單層芯片中，所有的通道排布于一個水平面上。單層芯片的優(yōu)點(diǎn)是易于設(shè)計(jì)制造和穩(wěn)定性高，缺點(diǎn)是無法安裝位于微流控芯片內(nèi)部的控制器。因此液體在單層芯片中流動的方向完全由外接設(shè)備提供的條件例如電場和外壓力來控制，不易對特定位置的液流進(jìn)行定點(diǎn)控制。在多層芯片中，通道排布于多個水平面上，在不同水平面上的通道之間既可以安裝彈性材料的薄膜用于實(shí)現(xiàn)薄膜閥和蠕動泵等控制器［13］，又可以制造垂直的通道將不同平面上的通道連接成三維通道網(wǎng)絡(luò)［15］。多層芯片的優(yōu)點(diǎn)是可以在微流控芯片的內(nèi)部使用控制器以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的功能，以及利用通道層數(shù)的優(yōu)勢提高單位體積內(nèi)結(jié)構(gòu)單元的數(shù)量;缺點(diǎn)是制造成本較高。液體在多層芯片中流動的方向可以由控制器和外接設(shè)備提供的條件共同來控制，易于對特定位置的液流進(jìn)行定點(diǎn)控制。對于SPR生物傳感器中的微流控芯片來說，也可以在垂直方向上將其分成流控部分(Fluidic Module)和基底部分(Substrate Module)。基底部分是帶有金屬膜的底板，用硬質(zhì)材料制成，通常情況下金屬膜是金膜是金膜(Gold Film)，底板材料是玻璃。流控部分則是除了基底部分之外的微流控芯片，包含所有的通道，其中與基底部分接觸的通道是開放通道(Open Channel)，也就是有一個側(cè)面敞開的通道。微流控芯片由流控部分和基底部分上下疊合起來組成，流控部分中的開放通道可以與基底部分形成側(cè)面帶有金屬膜的封閉通道，SPR生物傳感器測量的生物化學(xué)反應(yīng)在這些通道內(nèi)的金屬膜表面上進(jìn)行。

微流控芯片按照制造材料可以分為彈性材料芯片與非彈性材料芯片。彈性材料芯片主要以硅膠聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為制造材料，主要原因?yàn)?①PDMS可以使用高復(fù)制度的多層軟光刻模板印刷法(Multilayer Soft Lithography)進(jìn)行加工并且具有生物相容性［13，16－17］;②PDMS是制造薄膜閥的理想材料，以PDMS作為制造材料的微流控芯片可以大規(guī)模地使用微型薄膜閥以及在其基礎(chǔ)上構(gòu)建的微型蠕動泵來實(shí)現(xiàn)對流體的控制。彈性材料芯片也可能會在彈性材料之外使用少量硬質(zhì)材料，例如用于SPR測量的彈性材料芯片通常使用硬質(zhì)材料制成的基底部分。另一方面，非彈性材料芯片通常以玻璃、石英、單晶硅、塑料等硬質(zhì)材料作為主要制造材料，具有機(jī)械強(qiáng)度高的優(yōu)點(diǎn)［18－20］。其中，玻璃和石英的表面電化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，是理想的用于毛細(xì)管電泳的微流控芯片材料［21］。單晶硅是制造集成電路的材料，以單晶硅為制造材料的微流控芯片可以與電子學(xué)技術(shù)結(jié)合以拓寬應(yīng)用面［22］。以塑料為制造材料的微流控芯片可以用注塑加工來制造，價格便宜，適合工業(yè)化生產(chǎn)。非彈性材料芯片也可能會在硬質(zhì)材料之外使用少量的彈性材料，例如具有液流控制功能的非彈性材料芯片經(jīng)常使用PDMS薄膜構(gòu)建微型薄膜閥［23］。因?yàn)閺椥圆牧闲酒头菑椥圆牧闲酒饔袃?yōu)點(diǎn)，所以都有廣泛的應(yīng)用，也都被應(yīng)用于SPR生物傳感器中作為微型化的測量裝置。

在大部分情況下，微流控芯片在應(yīng)用時與合適的外接設(shè)備連接，由外接設(shè)備提供光源，電源，光電信號檢測器，自動化機(jī)械裝置，計(jì)算機(jī)等工具輔助微流控芯片完成其功能。流體運(yùn)動的推動力也可以由氣壓源和微量注射泵等外接設(shè)備來提供。外接設(shè)備的應(yīng)用是由于這些設(shè)備不能或者沒有必要安裝在微流控芯片上。對于SPR生物傳感器來說，SPR光學(xué)系統(tǒng)不參與生物化學(xué)反應(yīng)并且不需要微型化，因此可以作為外接設(shè)備與微流控芯片連接使用。通常情況下，商品化的SPR生物傳感器的外接設(shè)備具有強(qiáng)大的功能，加入了載物平臺和進(jìn)樣器等自動化機(jī)械裝置以及計(jì)算機(jī)，用于實(shí)現(xiàn)SPR測量的自動化。因此，這種外接設(shè)備也可以稱為SPR生物傳感器的儀器系統(tǒng)。

3 微流控芯片在表面等離子體共振生物傳感器中的應(yīng)用

在微流控技術(shù)的支持下，商品化的和實(shí)驗(yàn)室報道的SPR生物傳感器已經(jīng)廣泛使用微流控芯片作為微型化的測量裝置以提高其檢測效率。需要說明的是，大部分商品化的和一部分實(shí)驗(yàn)室報道的SPR生物傳感器不是使用已經(jīng)制成的微流控芯片，而是采用“實(shí)時組合”模式，在使用時將基底部分和流控部分組合成微流控芯片進(jìn)行SPR測量。因?yàn)樯锘瘜W(xué)反應(yīng)僅在基底部分的金屬膜表面上進(jìn)行，所以只有基底部分是SPR測量的耗材，流控部分可以重復(fù)使用。這種“實(shí)時組合”式的微流控芯片既降低了SPR測量的成本又有利于實(shí)現(xiàn)SPR生物傳感器的自動化，所以被工業(yè)界廣泛采用。在商品化的SPR生物傳感器中，作為耗材的基底部分通常被稱為傳感器芯片(Sensor Chip)。如果不是從微流控芯片的角度而是從儀器結(jié)構(gòu)的角度，也可以將商品化的SPR生物傳感器分為光學(xué)單元，液體處理單元和傳感器芯片，其中液體處理單元包括了微流控芯片的流控部分。傳感器芯片的金屬膜表面上可以進(jìn)行化學(xué)修飾，其作用是協(xié)助生物化學(xué)反應(yīng)在金屬膜表面上進(jìn)行。根據(jù)化學(xué)修飾的不同可以把傳感器芯片分為各種類型，適用于不同條件下的固相表面生物檢測。

對于SPR生物傳感器的微流控芯片來說，設(shè)計(jì)的目標(biāo)就是在實(shí)現(xiàn)這些反應(yīng)步驟的同時提高SPR生物傳感器的檢測效率，包括SPR生物傳感器的檢測通量、精確度、最低檢測限和檢測速度等。

微流控芯片的微型化特點(diǎn)本身就可以改進(jìn)SPR生物傳感器的最低檢測限和檢測速度。SPR生物傳感器的最低檢測限與樣品處理有關(guān)。當(dāng)用于固相表面生物檢測的樣品量很有限的時候，如果用傳統(tǒng)的較大尺度的測量裝置，必須對樣品溶液進(jìn)行稀釋以提供足夠的樣品溶液流過測量裝置與金屬膜表面接觸。如果使用微流控芯片，在反應(yīng)時間和樣品溶液流速不變的條件下，可以降低樣品溶液的稀釋程度。這是由于微流控芯片中的溶液輸送通道的截面積很小(通常在0.001～0.01mm2范圍內(nèi))，樣品溶液的流量也就是消耗量降低了。因此，微流控芯片可以通過減少對樣品溶液的稀釋來間接地改進(jìn)SPR生物傳感器的最低檢測限。

當(dāng)SPR生物傳感器用于實(shí)現(xiàn)固相表面生物檢測的時候，在金屬/溶液界面上進(jìn)行的結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)的反應(yīng)動力學(xué)通常以Langmuir模型作為基礎(chǔ)推理得出。根據(jù)Langmuir吸附等溫式，反應(yīng)動力學(xué)可以用方程(1)表示［24］。其中θ是分析物分子在金屬膜表面上的覆蓋率，即已經(jīng)在金屬膜表面上與配體物分子結(jié)合的分析物分子密度SA和分析物分子在金屬膜表面上可能達(dá)到的最大密度之間的比值SA/(可以根據(jù)固定在金屬膜表面上的總配體物分子密度乘以結(jié)合反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量數(shù)得到)，也可以用尚未與分析物分子結(jié)合的配體物分子密度SL和總配體物分子密度之間的關(guān)系式(－SL)/表示。是分析物分子在樣品溶液中的濃度，是分析物分子在金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)的濃度，在穩(wěn)態(tài)時兩者之間的關(guān)系可以用方程(2)表示［8］。造成與不同的原因是在金屬/溶液界面上進(jìn)行的結(jié)合反應(yīng)屬于非均相反應(yīng)，只有在界面鄰近區(qū)域內(nèi)的分析物分子可以直接參與，反應(yīng)器中其他的分析物分子必須通過傳質(zhì)過程進(jìn)入界面鄰近區(qū)域內(nèi)才能參與結(jié)合反應(yīng)。km是傳質(zhì)速率常數(shù)，用于衡量分析物分子在樣品溶液中的傳質(zhì)速率。k1和k2分別是分析物分子與配體物分子結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)。由方程(1)和(2)可以得到在金屬膜表面上已經(jīng)與分析物分子結(jié)合的配體物分子密度隨時間變化的動力學(xué)方程(3)，顯示出傳質(zhì)速率常數(shù)km對反應(yīng)速率的影響。當(dāng)傳質(zhì)速率常數(shù)km遠(yuǎn)大于結(jié)合反應(yīng)速率常數(shù)k1時，也就是在高傳質(zhì)速率的情況下，反應(yīng)速率與傳質(zhì)動力學(xué)基本無關(guān)，僅由反應(yīng)動力學(xué)決定。但是，當(dāng)傳質(zhì)速率常數(shù)km接近或者小于結(jié)合反應(yīng)速率常數(shù)k1時，反應(yīng)速率因?yàn)槭艿絺髻|(zhì)過程的限制會低于高傳質(zhì)速率的情況。由于傳質(zhì)速率常數(shù)km與反應(yīng)器高度的三分之一次方成反比［8］，微流控芯片中的反應(yīng)器具備的微型化特點(diǎn)有利于提高傳質(zhì)速率，減少傳質(zhì)過程對反應(yīng)速率的限制。所以，微流控芯片可以加快固相表面生物檢測中的結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)的反應(yīng)速率，改進(jìn)SPR生物傳感器的檢測速度。

微流控芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以提高SPR生物傳感器的檢測通量和準(zhǔn)確度。在SPR生物傳感器中，微流控芯片的反應(yīng)器是底面帶有金屬膜的通道。與液體輸送管道相比，反應(yīng)器通常具有不同的形狀，但是有時候反應(yīng)器也可以是液體輸送管道的一部分。微流控芯片的設(shè)計(jì)重點(diǎn)在于如何排布液體輸送管道、反應(yīng)器、控制器等結(jié)構(gòu)單元，使得固相表面生物檢測所需的配體物分子和分析物分子被高效率地輸送到反應(yīng)器，在金屬/溶液界面上進(jìn)行相互作用。根據(jù)配體物分子和分析物分子被輸送到反應(yīng)器的方式，微流控芯片的設(shè)計(jì)可以分為連續(xù)輸送型設(shè)計(jì)，交叉輸送型設(shè)計(jì)和液體動力輸送型設(shè)計(jì)等。

3.1 連續(xù)輸送型設(shè)計(jì)

在連續(xù)輸送型設(shè)計(jì)中，反應(yīng)器處在一條液體輸送管道當(dāng)中，反應(yīng)溶液通過這條液體輸送管道流經(jīng)反應(yīng)器，配體物分子和分析物分子在反應(yīng)器中的金屬膜表面上進(jìn)行相互作用。與液體輸送管道相比，通常反應(yīng)器是一個具有較大流動空間的通道。大部分連續(xù)輸送型設(shè)計(jì)把一定數(shù)量的相同的反應(yīng)器平行排布于微流控芯片中，使其能夠同時進(jìn)行多個結(jié)合反應(yīng)，提高SPR生物傳感器的檢測通量。對于在這類微流控芯片中進(jìn)行的固相表面生物檢測來說，由于到達(dá)每一個反應(yīng)器的配體物和分析物都來自同一條液體輸送管道，如果不重復(fù)使用配體物或者分析物的話，相互作用的種類數(shù)NR與配體物的種類數(shù)NL及分析物的種類數(shù)NA之間應(yīng)該是NR= NA=NL的關(guān)系。如果固相表面生物檢測的步驟包括對金屬膜表面上的配體物分子進(jìn)行重活化(Regeneration)的步驟，分析物的種類數(shù)NA就可以不受限制，各種類數(shù)之間應(yīng)該是NR=NA＞NL的關(guān)系。與其他設(shè)計(jì)相比，這種設(shè)計(jì)的優(yōu)勢在于反應(yīng)器之間沒有連接，反應(yīng)溶液之間不易混合，保證了測量的準(zhǔn)確度。具有代表性的連續(xù)輸送型設(shè)計(jì)的微流控芯片包括以下幾種。

1)美國Washington大學(xué)(Seattle)的研究人員報道的微流控芯片［25］。這種微流控芯片用一條液體輸送管道連接了反應(yīng)器和多個具有分離和混合等樣品處理功能結(jié)構(gòu)單元。因此，經(jīng)過簡單過濾的唾液樣品可以直接進(jìn)入微流控芯片，經(jīng)過樣品處理之后進(jìn)入反應(yīng)器，其中的分析物分子在反應(yīng)器中的金膜表面上與配體物分子進(jìn)行相互作用。這種微流控芯片實(shí)現(xiàn)了多種功能的集成化，有利于實(shí)現(xiàn)自動化的SPR生物傳感器。

2)臺灣成功大學(xué)和清華大學(xué)的研究人員報道的微流控芯片［26］。這種微流控芯片帶有平行排布的液體輸送管道和反應(yīng)器，金膜位于反應(yīng)器的底面上。微流控芯片中的薄膜閥可以控制液體的流動。配體物分子和分析物分子經(jīng)過同一條液體輸送管道進(jìn)入每個反應(yīng)器，在金膜表面上進(jìn)行相互作用。除了用于反應(yīng)器當(dāng)中的金膜，這種微流控芯片還在靠近反應(yīng)器的位置裝有用于加熱的金膜，可以有效地控制反應(yīng)溫度，提高SPR測量的準(zhǔn)確度。

3)美國Utah大學(xué)的研究人員報道的“實(shí)時組合”式的微流控芯片，由流控部分和帶有金膜的基底部分組成［27］。這種微流控芯片的流控部分帶有垂直于金膜表面的液體輸送管道，液流在其中的流動方向垂直于金膜表面，不同于大部分微流控芯片中液流平行于金屬膜表面的設(shè)計(jì)。為實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計(jì)，液體在液體輸送管道的轉(zhuǎn)彎處通過側(cè)面的開口與金膜接觸，液體輸送管道的轉(zhuǎn)彎處加上開口處的金膜可以被認(rèn)為是反應(yīng)器。在這種微流控芯片中，金膜位于反應(yīng)器的側(cè)面上，因此可以構(gòu)建垂直于金膜表面的液體輸送管道。配體物分子和分析物分子經(jīng)過同一條液體輸送管道進(jìn)入每個反應(yīng)器，在金膜表面進(jìn)行相互作用。如圖4所示，這種微流控芯片的結(jié)構(gòu)類似于微孔板(Microplate)，液體輸送管道的開口在側(cè)面形成一個二維陣列，與金膜接觸時可以形成一個反應(yīng)器陣列。實(shí)現(xiàn)高通量的固相表面生物檢測。液體輸送管道垂直于金屬膜表面有利于分析物分子的傳質(zhì)過程，使得分析物分子可以更快地進(jìn)入金屬/溶液界面鄰近區(qū)域內(nèi)，提高結(jié)合反應(yīng)的反應(yīng)速率。

4)通用電氣公司(GE)屬下的Biacore公司開發(fā)的Biacore 1000生物傳感器中的“實(shí)時組合”式的微流控芯片，由作為流控部分的IFC(Integrated Microfluidic Cartridge)和作為基底部分的帶有金膜的傳感器芯片組成［1］。這種微流控芯片的流控部分帶有平行排布的反應(yīng)器，配體物分子和分析物分子經(jīng)過同一條液體輸送管道進(jìn)入每個反應(yīng)器，在反應(yīng)器中的金膜表面上進(jìn)行相互作用。液體的流動方向由薄膜閥控制。液體輸送管道除了與反應(yīng)器連接的部分，還包括定量環(huán)(Sample Loop)部分，因此可以在微流控芯片上準(zhǔn)確地量取樣品溶液。

5)日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST)的研究人員報道的微流控芯片［28］。這種微流控芯片的T形通道將兩個金膜串聯(lián)使用，在第一個金膜表面上進(jìn)行配體物分子與分析物分子的結(jié)合反應(yīng)，然后在第二個金膜表面上測量第一個金膜表面上的分析物分子催化的酶促反應(yīng)進(jìn)程。通過酶促反應(yīng)進(jìn)程可以間接地得到樣品溶液中的分析物分子濃度，從而推測出樣品溶液中的被測物分子濃度。由于SPR生物傳感器測量的分析物不是樣品中的被測物，這種檢測屬于間接型的固相表面生物檢測。在這種微流控芯片中，兩個金膜協(xié)同完成一種配體物和一種分析物的結(jié)合反應(yīng)以及SPR測量。所以這種微流控芯片的設(shè)計(jì)可以算作對連續(xù)輸送型設(shè)計(jì)的一種改進(jìn)。

3.2 交叉輸送型設(shè)計(jì)

在交叉輸送型設(shè)計(jì)中，反應(yīng)器處在兩條液體輸送管道的交叉點(diǎn)，反應(yīng)溶液分別通過這兩條液體輸送管道流經(jīng)反應(yīng)器，配體物分子和分析物分子在反應(yīng)器中的金屬膜表面上進(jìn)行相互作用。對于在這類微流控芯片中進(jìn)行的固相表面生物檢測來說，由于到達(dá)每一個反應(yīng)器的配體物和分析物分別來自兩條交叉的液體輸送管道，如果不重復(fù)使用配體物或者分析物的話，相互作用的種類數(shù)NR與配體物的種類數(shù)NL及分析物的種類數(shù)NA之間有NR=NA×NL的關(guān)系。與連續(xù)輸送型設(shè)計(jì)類似，如果固相表面生物檢測的步驟包括對金屬膜表面上的配體物分子進(jìn)行重活化的步驟，分析物的種類數(shù)NA就可以不受限制，但是各種類數(shù)之間仍然是NR=NA×NL的關(guān)系。

交叉輸送型設(shè)計(jì)的微流控芯片適用于高通量的交叉篩選，就是將幾種配體物與幾種分析物一對一地進(jìn)行相互作用以篩選出具有反應(yīng)活性的分析物。這是因?yàn)樵诮徊孑斔托驮O(shè)計(jì)中相互作用的種類數(shù)是配體物和分析物的種類數(shù)的乘積，既簡化了反應(yīng)溶液的輸送又降低了反應(yīng)溶液的消耗，對于交叉篩選具有最高的效率。具有代表性的交叉輸送型設(shè)計(jì)的微流控芯片包括以下幾種。

1)美國Wisconsin大學(xué)Madison分校的研究人員以及荷蘭Twente大學(xué)的研究人員報道的“實(shí)時組合”式的微流控芯片，由流控部分和帶有金膜的基底部分組成［29－31］。在使用過程中，流控部分在旋轉(zhuǎn)90度之前和之后兩次與基底部分組合，在水平方向上先后形成兩組交叉的通道，分別用于輸送配體物和分析物。配體物分子和分析物分子在位于兩組通道交叉點(diǎn)的金膜表面上進(jìn)行相互作用，交叉點(diǎn)位置上的通道和金膜可以認(rèn)為是微流控芯片的反應(yīng)器。這種設(shè)計(jì)也可以允許先后使用兩種不同的流控部分輸送配體物和分析物，例如使用帶有多條平行通道的流控部分輸送配體物和帶有一條彎曲通道的流控部分輸送分析物，輸送分析物的通道與輸送配體物的通道來回交叉，使得每一種分析物分子與配體物分子的相互作用都在位于不同通道交叉點(diǎn)的金膜表面上重復(fù)進(jìn)行，以此提高SPR檢測的精確度［30］。

2)美國Stanford大學(xué)研究人員報道的微流控芯片［32］。這種微流控芯片的流控部分使用彈性材料PDMS制造，制造方法遵循專門用于PDMS微流控芯片的多層軟光刻模板印刷法，就是將帶有開放通道的PDMS層加上基底部分按照順序上下疊合形成帶有多層通道的微流控芯片，如圖5A所示?；撞糠质菐в袌A形金膜的玻璃片。這種微流控芯片由兩層通道組成，兩層通道之間僅有幾十微米厚度的PDMS薄膜作為間隔，在兩層通道的交會處，這樣的PDMS薄膜可以在壓力作用下發(fā)生形變，作為薄膜閥使用。上層被稱為控制層(Control Layer)，因?yàn)樯蠈油ǖ缹ｉT用來制造微流控芯片中的薄膜閥，以便在外接設(shè)備提供的壓力下控制下層通道中液流的方向。下層被稱為流動層(Flow Layer)，因?yàn)閰⑴c固相表面生物檢測的反應(yīng)溶液在下層通道中流動。流動層通道由兩組交叉的液體輸送管道陣列和位于交叉點(diǎn)的反應(yīng)器組成，金膜位于反應(yīng)器的底面上。配體物分子和分析物分子分別經(jīng)過這兩組液體輸送管道進(jìn)入反應(yīng)器，在金膜表面上進(jìn)行相互作用。這種微流控芯片可以同時在96個反應(yīng)器中的金膜表面上進(jìn)行配體物分子與分析物分子的相互作用，且每一種結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)都在4個相鄰的金膜表面上重復(fù)進(jìn)行，以此提高SPR測量的精確度。在使用這種微流控芯片時，推動控制層中的薄膜閥和流動層中的液流所需的氣壓由外接設(shè)備來提供。圖5B展示了在使用過程中的微流控芯片以及微流控芯片的反應(yīng)器區(qū)域在SPR生物傳感器的光學(xué)系統(tǒng)中的成像。

圖5 Stanford大學(xué)研究人員報道的微流控芯片

3)Bio－Rad公司開發(fā)的ProteOnTMXPR36生物傳感器中的“實(shí)時組合”式的微流控芯片，由作為流控部分的MCM(Multichannel Module)和作為基底部分的帶有金膜的傳感器芯片組成［33］。這種微流控芯片的流控部分帶有平行的開放通道，可以與傳感器芯片組合形成在一個側(cè)面上帶有金屬膜的封閉通道。流控部分固定在外接設(shè)備的機(jī)械平臺上，能夠自動旋轉(zhuǎn)和升降，因此可以與基底部分自動進(jìn)行組合。在使用過程中，流控部分在旋轉(zhuǎn)90度之前和之后兩次與傳感器芯片進(jìn)行組合，在同一個水平面上先后形成兩組互相垂直的通道，可以分別用于輸送配體物和分析物。配體物分子和分析物分子在位于兩組通道交叉點(diǎn)的金膜表面上進(jìn)行相互作用，交叉點(diǎn)位置上的通道和金膜可以認(rèn)為是微流控芯片的反應(yīng)器。如圖6A所示，這種微流控芯片的流控部分帶有6條平行排布的開放通道，與傳感器芯片的兩次組合能夠產(chǎn)生36個陣列式排布的通道交叉點(diǎn)，所以可以同時在36個位于通道交叉點(diǎn)的金膜表面上進(jìn)行配體物分子與分析物分子的相互作用。因?yàn)榫哂休^高的檢測通量，ProteOn XPR36生物傳感器也稱為陣列式蛋白質(zhì)相互作用分析系統(tǒng)(Protein Interaction Array System)。此外，在輸送分析物分子時，在交叉點(diǎn)兩邊沒有配體物分子的金膜與交叉點(diǎn)的金膜與同一股液流接觸且位置靠近，具備相近的反應(yīng)條件，可以準(zhǔn)確地提供SPR測量背景，提高SPR測量的準(zhǔn)確度。相比于其他已報道的非自動控制的“實(shí)時組合”式的微流控芯片［29－31］，ProteOn XPR36生物傳感器中的微流控芯片具有兩個優(yōu)勢:①流控部分與基底部分的組合可以自動進(jìn)行，既節(jié)省了固相表面生物檢測所需的時間和工作量，又提高了多次使用時反應(yīng)器位置的可重復(fù)性。②金膜表面上覆蓋的聚糖類分子簡化了固定配體物分子的反應(yīng)步驟，避免了使用高濃度的有機(jī)溶劑對流控部分可能造成的損壞，因此固相表面生物檢測的反應(yīng)步驟都可以在微流控芯片中實(shí)現(xiàn)。這些特點(diǎn)使得微流控芯片的使用過程便于機(jī)械化控制。如圖6B所示，微流控芯片可以在外接設(shè)備ProteOn XPR36儀器系統(tǒng)的輔助下實(shí)現(xiàn)ProteOn XPR36生物傳感器的全面自動化，得到穩(wěn)定且重復(fù)性高的SPR傳感器譜圖。

圖6 Bio-Rad公司開發(fā)的ProteOn XPR36生物傳感器中的微流控芯片

將微陣列生物芯片(Microarray Biochip)和微流控芯片結(jié)合也可達(dá)到交叉輸送型設(shè)計(jì)的效果:①使用帶有金膜的載體，通過點(diǎn)樣技術(shù)將配體物固定在金膜表面上制成微陣列生物芯片。②將微陣列生物芯片作為基底部分與流控部分組合形成微流控芯片，金膜作為反應(yīng)器的底面。這類微流控芯片通常采用“實(shí)時組合”模式，其中的反應(yīng)器是一個具有較大流動空間的通道，也可稱為流通池(Flow Cell)。分析物分子通過液體輸送管道進(jìn)入反應(yīng)器，與配體物分子在金膜表面上進(jìn)行相互作用。也就是說，配體物的輸送在微流控芯片之外完成。這種設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是可以將上百種配體物固定在金膜表面上，且配體物的位置不受微流控芯片中通道位置的限制，適用于要測量多種配體物的固相表面生物檢測。但是，如果能夠?qū)鹉け砻嫔系呐潴w物分子進(jìn)行重活化，就可以測量多種分析物，達(dá)到交叉輸送型設(shè)計(jì)的效果。這種將微陣列生物芯片和微流控芯片結(jié)合的方法被用于Biacore公司開發(fā)的Flexchip，GenOptics公司開發(fā)的SPRi－Plex和SPRi－Lab+，Toyobo公司開發(fā)的MultiSPRinter，Graffinity Pharmaceuticals公司開發(fā)的Plasmon Imager，IBIS Technologies公司開發(fā)的 iSPR等商品化的 SPR生物傳感器［1］，以及Washington大學(xué)(Seattle)的研究人員以及Alberta大學(xué)的研究人員報道的SPR生物傳感器［34－35］。

3.3 流體動力輸送型設(shè)計(jì)

在微流控芯片的微型通道里，液體流動的類型以層流為主。因此，在沒有湍流的情況下，在微流控芯片中互相接觸的平行液流不會混合，液流之間僅通過分子擴(kuò)散來傳質(zhì)。根據(jù)這個特點(diǎn)，Washington大學(xué)(Seattle)的研究人員報道了用于測量小分子樣品的微流控芯片［36－37］。這種微流控芯片可以在平行液流的分界線附近利用分子擴(kuò)散進(jìn)行被測物分子與分析物分子的相互作用，間接地改變分析物分子與配體物分子在金膜表面上進(jìn)行的結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)進(jìn)程，以此來測量被測物分子濃度。由于SPR生物傳感器測量的分析物不是樣品中的被測物，這種檢測屬于間接型固相表面生物檢測。另一方面，在微流控芯片中也可以利用互相接觸的平行液流之間的作用力來改變液流的流動空間，這種利用流體力學(xué)原理輸送反應(yīng)溶液的方式被稱為流體動力配置(Hydrodynamic Addressing)。Biacore公司的研究人員使用流體動力配置型設(shè)計(jì)開發(fā)了“實(shí)時組合”式的微流控芯片，由作為流控部分的IFC和作為基底部分的傳感器芯片組成［38］。這種類型的微流控芯片應(yīng)用于Biacore S51和BiacoreA100生物傳感器中。在這種微流控芯片中的反應(yīng)器有兩個進(jìn)口和一個出口，固相表面生物檢測所需的反應(yīng)溶液與空白溶液分別從兩個進(jìn)口注入反應(yīng)器，成為互相接觸的平行液流。由于互相接觸的平行液流會在有限容器中競爭流動空間，推動兩種溶液運(yùn)動的壓強(qiáng)差決定了反應(yīng)溶液在反應(yīng)器中占有的流動空間，也決定了反應(yīng)溶液在反應(yīng)器底面上覆蓋的面積。因?yàn)榻鹉り嚵形挥诜磻?yīng)器底面上，所以通過壓強(qiáng)差可以調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液覆蓋的金膜的數(shù)量，使得各種配體物分子與分析物分子的相互作用可以在不同的金膜表面上進(jìn)行。Biacore A100生物傳感器中的微流控芯片擁有4個平行排布的分別帶有5個金膜的反應(yīng)器，可以同時在20個金屬膜表面上進(jìn)行配體物分子與分析物分子的相互作用。這種設(shè)計(jì)可以提高SPR測量的準(zhǔn)確度，因?yàn)榭梢允褂靡粋€金膜為處于同一股液流之中的其他具備相近反應(yīng)條件的金膜提供SPR測量背景。同時這種微流控芯片適合機(jī)械化控制，可以在外接設(shè)備BiacoreA100儀器系統(tǒng)的輔助下實(shí)現(xiàn)SPR生物傳感器的全面自動化。

4 總結(jié)

與傳統(tǒng)的用于固相表面生物檢測的實(shí)驗(yàn)工具例如微孔板相比，SPR生物傳感器顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢:①不需要對分析物進(jìn)行標(biāo)記的特點(diǎn)既節(jié)約了標(biāo)記用的試劑和反應(yīng)步驟，又使得實(shí)時測量固相表面生物檢測中的每一個反應(yīng)步驟成為可能。②在固相表面生物檢測的反應(yīng)步驟中，分析物溶液或者空白反應(yīng)溶液在反應(yīng)器中流動更新，可以在結(jié)合反應(yīng)中補(bǔ)充分析物分子的消耗或者在解離反應(yīng)中維持沒有分析物分子的溶液環(huán)境。與傳統(tǒng)的不更新分析物溶液的實(shí)驗(yàn)工具相比，SPR生物傳感器既提高了反應(yīng)速率又方便了反應(yīng)動力學(xué)計(jì)算。當(dāng)使用微流控芯片作為測量裝置時，SPR生物傳感器可以在一小時內(nèi)完成傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)工具需數(shù)小時才能完成的固相表面生物檢測。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，微流控芯片的設(shè)計(jì)在持續(xù)地改進(jìn)，各種微流控芯片可以從不同的方面提高SPR生物傳感器的檢測效率，包括檢測通量，精確度，最低檢測限和檢測速度等。對于SPR生物傳感器來說，應(yīng)用微流控芯片作為微型化的測量裝置是將來的發(fā)展趨勢。以在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界廣泛的應(yīng)用前景作為推動力，這個研究領(lǐng)域?qū)^續(xù)發(fā)展。

本文對于SPR原理的介紹得到了俞枋博士(師從SPR權(quán)威Wolfgang Knoll教授)的幫助和指正，在此表示誠摯的謝意。

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