腺病毒載體攜帶HSV1-TK報(bào)告基因感染BMSCs后攝取131I-FIAU的實(shí)驗(yàn)研究

張斌青 吳 濤 孫 遜 安 銳

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖北省分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430022）

放射性核素報(bào)告基因顯像技術(shù)在基因治療領(lǐng)域的研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)展[1–3]，但轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞進(jìn)入活體后干細(xì)胞歸巢、分化、功能表達(dá)以及外源基因表達(dá)部位和時(shí)間等研究較少。HSV1-TK/氟-碘阿糖呋喃基-尿嘧啶(2'-fluoro-2'-deoxy-1-β-Darabinofuranosyluracil, FIAU)是較成熟的放射性核素報(bào)告基因系統(tǒng)之一[2–4]。本研究利用攜帶報(bào)告基因(HSV1-TK)和治療基因(BDNF)的重組腺病毒載體感染體外培養(yǎng)的BMSCs，研究重組腺病毒載體對(duì)BMSCs的增殖能力和誘導(dǎo)分化神經(jīng)元細(xì)胞的影響，兩目的基因表達(dá)的相關(guān)性分析，對(duì)放射性核素標(biāo)記報(bào)告探針FIAU的攝取情況，為以后放射性核素報(bào)告基因活體監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因BMSCs治療腦梗死奠定基礎(chǔ)。

與胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞相比，BMSCs作為移植治療腦梗死的供體細(xì)胞具有如下優(yōu)點(diǎn)：取材方便，免疫反應(yīng)弱，可在宿主神經(jīng)系統(tǒng)中長(zhǎng)期存活，且無胚胎干細(xì)胞移植治療遇到的倫理學(xué)問題。其自我更新能力較強(qiáng)，是基因治療理想靶細(xì)胞，因此轉(zhuǎn)基因BMSCs成為細(xì)胞移植治療的熱點(diǎn)[6,7]。但對(duì)轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞的歸巢數(shù)量、動(dòng)態(tài)變化以及外源基因表達(dá)部位和時(shí)間，目前缺乏有效示蹤手段。常用的活體示蹤轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞技術(shù)，有光學(xué)成像、磁共振成像、放射性核素成像。光學(xué)成像的熒光光子穿透力較弱；磁共振成像的示蹤靈敏度低，直接標(biāo)記干細(xì)胞可能影響干細(xì)胞增殖和分化能力[8]。放射性核素報(bào)告基因示蹤轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞將報(bào)告基因和治療基因偶聯(lián)，通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入干細(xì)胞，用放射性核素標(biāo)記探針顯示體內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)，以間接示蹤干細(xì)胞和治療基因的表達(dá)，具有無創(chuàng)傷和高靈敏的特點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞活體示蹤開辟了一條新的途徑。放射性核素報(bào)告基因系統(tǒng)，可以酶為基礎(chǔ)和受體，如 HSV1-TK[2–4]；或以轉(zhuǎn)運(yùn)體為基礎(chǔ)，如多巴胺D2受體(D2R)、生長(zhǎng)抑素受體(SSTR)及鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)[9]。以酶為報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)主要是酶的信號(hào)放大作用，此外酶報(bào)告基因多為外源性物質(zhì)，避免了體內(nèi)的非特異顯像，其中HSV1-TK/FIAU是應(yīng)用最多也是最成熟的報(bào)告基因系統(tǒng)之一。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM-F12培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；FAU，美國(guó)Moravek生物公司；重組腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP及對(duì)照病毒Ad5-EGFP，上海鳴宏生物有限公司構(gòu)建、包裝、鑒定及滴度測(cè)定；Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP和Ad5-EGFP的 MOI分別為 2.0×1010PFU/mL 和3.6×1010PFU/mL；bFGF和EGF，美國(guó)Protein Tech公司；PCR引物，上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，歐盟Ferments公司；Trizol、SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG，美國(guó)Invitrogen公司；Iodogen (1,3,4,6,-1,3,4,6-tetrachloro-3alpha, 6-alphadiphenylglucoluril)、MTT、化學(xué)試劑，美國(guó) Sigma公司；無載體無還原劑131I-NaI，北京原子高科公司；綠色熒光顯微鏡(TE 2000-U)，日本尼康公司；RQ-PCR儀，美國(guó)ABI公司(ABI1900)；Sep-Pak C18反相色譜層析柱，美國(guó)Waters公司；快速薄層層析-硅膠紙(TLC-SG)，上海仕元科學(xué)器材有限公司；γ計(jì)數(shù)器，合肥眾成機(jī)電技術(shù)公司；正常SD大鼠，

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的BMSCs

取2–4代BMSCs均勻接種于培養(yǎng)孔中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞換液，加入無血清培養(yǎng)基。計(jì)數(shù)孔內(nèi)細(xì)胞，按病毒不同 MOI計(jì)算所需病毒體積，加入培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，加入含15%胎牛血清的DMEM-F12，繼續(xù)培養(yǎng)，備用。分別于24、36、48、72、96 h在熒光顯微鏡下觀察感染重組腺病毒細(xì)胞的綠色熒光細(xì)胞陽(yáng)性率，未感染病毒 BMSCs為陰性對(duì)照組。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)感染BMSCs活力

不同MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNFEGFP感染BMSCs 48 h后，在各孔內(nèi)同時(shí)滴加MTT溶液(5 g/L) 2×10–5L，37℃培養(yǎng) 4 h，棄上清，避光，每孔加入1.5×10–4L二甲基亞砜，振蕩10 min，酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔490 nm吸光值A(chǔ)，計(jì)算BMSCs存活率=[A感染組/A陰性對(duì)照組]×l00%，繪制曲線。

1.2.3 感染BMSCs誘導(dǎo)分化

對(duì)重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP感染組和陰性對(duì)照組均加入終濃度為200 ng/L的bFGF和EGF，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)72 h，分別于6、12、24、36、48、72 h于倒置顯微鏡下觀察，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化情況。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR

不同 MOI重組腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNFEGFP感染BMSCs，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，以感染病毒Ad5-EGFP為對(duì)照組。感染48 h后加入適量Trizol，按操作說明書提取總RNA，cDNA合成按Ferments逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成。QR-PCR反應(yīng)體系為20μL，熒光定量PCR儀擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，利用2－△△CT方法分析兩目的基因的相對(duì)表達(dá)量(CT)。所用引物和擴(kuò)增片段大小見表1。

表1 目的基因引物和擴(kuò)增獲得片段大小Table 1 The amplified fragments size and sequence of target gene primers.

1.2.5131I-FIAU的制備

放射性核素碘標(biāo)記 FAU參照王瑞華等[5]采用的Indogen固相氧化法。以Sep-Pak C-18反相色譜層析柱對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記率分析。從131I-FIAU峰管取樣點(diǎn)于 TLC-SG硅膠板，以乙酸乙酯:丙酮:水=14:8:1的混合液為展開劑進(jìn)行層析，測(cè)定放射化學(xué)純度。標(biāo)記物在正常人血清和 PBS中 37℃下孵育4、12、24 h，分別取樣測(cè)定放射化學(xué)純度，評(píng)價(jià)標(biāo)記物的穩(wěn)定性。

1.2.6 細(xì)胞攝取

重組腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP感染BMSCs 48 h后進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，以對(duì)照腺病毒Ad5-EGFP為對(duì)照組。每組細(xì)胞隨機(jī)分10個(gè)小組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入純化后的131I-FIAU 74 kBq，分別于 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 h收集細(xì)胞，培養(yǎng)孔內(nèi)的放射性培養(yǎng)基收集入試管，用0.1 mmol/L NaOH消化細(xì)胞后也收入相應(yīng)的試管，測(cè)定培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的γ計(jì)數(shù)，攝取率=[C細(xì)胞懸液/(C細(xì)胞懸液+C細(xì)胞培養(yǎng)基)]×100%。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，線性相關(guān)采用Pearson分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒對(duì)BMSCs的感染率及MTT檢測(cè)細(xì)胞力

重組腺病毒感染BMSCs 24 h后在熒光顯微鏡下即可見綠色熒光細(xì)胞，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，綠色熒光細(xì)胞陽(yáng)性率有所增加，48 h時(shí)達(dá)峰值，且MOI為150時(shí)綠色熒光細(xì)胞陽(yáng)性率>90%(圖1)，72 h后熒光數(shù)量開始下降。在倒置顯微鏡下可見，各組感染細(xì)胞形態(tài)在觀察時(shí)間內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)均無明顯變化，MOI為250時(shí)僅可見極個(gè)別漂浮細(xì)胞，胎盤藍(lán)染色證實(shí)為死亡細(xì)胞。MTT證實(shí)感染重組腺病毒BMSCs的增殖能力無明顯影響，MOI為 150時(shí)BMSCS活力仍>98%(圖 2)。

圖1 MOI為150感染BMSCs 48 h綠色熒光顯微鏡下觀察(×100)Fig.1 Green fluorescent protein expression in BMSCs after infected with recombinant adenovirus (MOI=150). (×100)

2.2 感染BMSCs誘導(dǎo)分化能力

重組腺病毒MOI為150時(shí)，感染Ad5-TK-IRESBDNF-EGFP組和陰性對(duì)照組經(jīng)bFGF和EGF誘導(dǎo)分化， 6、12、24、36、48、72 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后36 h，部分細(xì)胞分化，胞體向核收縮呈梭形，有折光性，有較多的長(zhǎng)突起，類似神經(jīng)元細(xì)胞，72 h后可見大部分細(xì)胞呈神經(jīng)元樣改變，且兩組無明顯差別(圖3)。

圖2 感染重組腺病毒的BMSCs存活率曲線圖Fig.2 Survival curve of BMSCs infected with recombinant adenovirus.

圖3 誘導(dǎo)分化72 h后相差顯微鏡下觀察A 陰性對(duì)照組; B 腺病毒感染組 (×200)Fig.3 Morphology under phase-contrast microscope 72 h after inducement A, the control; B, the Ad5-infected. (×200)

2.3 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)兩目的基因表達(dá)及相關(guān)性分析

不同 MOI重組腺病毒感染 BMSCs后經(jīng)QR-PCR證實(shí)均有目的基因TK和BDNF的表達(dá)，而對(duì)照組則無明顯表達(dá)。經(jīng)QR-PCR獲得擴(kuò)增曲線，利用 2－△△CT方法進(jìn)行分析，計(jì)算CT，結(jié)果如圖 4所示。各組感染細(xì)胞均有目的基因表達(dá)，且隨著病毒MOI的增加而表達(dá)增加。數(shù)據(jù)經(jīng))Pearson相關(guān)分析，兩目的基因的表達(dá)水平有良好相關(guān)性(r=0.973，P<0.05，n=3)。

圖4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)Fig.4 Expression of target gene detected with real-time PCR.

2.4 131I-FIAU制備結(jié)果

Sep-Pak C-18反相色譜層析柱對(duì)標(biāo)記物經(jīng)純化后，可見兩個(gè)計(jì)數(shù)峰，文獻(xiàn)[5]已證實(shí)第一個(gè)峰的淋洗液經(jīng)硅膠板薄層層析表明其Rf值為0.3，與無載體無還原劑131I-NaI經(jīng)相同的展開系統(tǒng)進(jìn)行TLC-SG得到相同的結(jié)果，證明此峰是131I峰；第二個(gè)峰的淋洗液經(jīng)TLC-SG表明Rf值為0.7–0.9，證明是標(biāo)記產(chǎn)物131I-FIAU。經(jīng)測(cè)定，標(biāo)記率為(64.35±4.89)% (n=5)；TLC-SG硅膠板層析法測(cè)定，131I-FIAU的放射化學(xué)純度為(98.62±0.62)% (n=5)。131I-FIAU在正常人血清和PBS中37℃中孵育24 h后，放射化學(xué)純度仍>95%。

2.5 重組腺病毒感染BMSCs后對(duì)131I-FIAU的攝取研究

MOI為150時(shí)感染BMSCs。由圖5，3 h內(nèi)感染目的基因細(xì)胞對(duì)131I-FIAU的攝取程度與時(shí)間呈正相關(guān)，3 h時(shí)的131I-FIAU攝取率達(dá)(31.42± 0.46)%(n=3)，此后增加不明顯。各時(shí)間點(diǎn)的感染目的基因細(xì)胞攝取率均顯著高于對(duì)照組(t=23.06–173.83，P<0.05，n=3)。

圖5 腺病毒感染BMSCs后對(duì)131I-FIAU的攝取率Fig.5 131I-FIAU uptake in BMSCs infectedby recombinant adenovirus.

3 討論

將兩個(gè)目的基因偶聯(lián)的常用技術(shù)主要有融合基因、雙啟動(dòng)子及IRES技術(shù)，本研究將IRES作為兩目的基因的鏈接工具，其優(yōu)點(diǎn)在于上下游基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，上游基因的表達(dá)可間接反映下游基因的表達(dá)，二者具有良好的相關(guān)性；此外 IRES翻譯出的蛋白具備各自的空間構(gòu)象，與融合基因相比避免了蛋白空間折疊可能引起的功能障礙。本研究證明，IRES介導(dǎo)的兩目的基因可同時(shí)表達(dá)，隨著病毒MOI的增加而表達(dá)增加，mRNA的表達(dá)量有良好的線性相關(guān)，上游基因的表達(dá)可間接反映下游基因的表達(dá)，由此可以推斷，在體內(nèi)亦可通過報(bào)告基因的表達(dá)數(shù)量和數(shù)部位來間接反映治療基因的數(shù)量和部位，對(duì)治療基因進(jìn)行定量分析和示蹤。

理想的報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞應(yīng)該不僅能攜帶較多的堿基，而且在體外可獲得較高的感染滴度，感染后不影響干細(xì)胞的增殖和分化功能?，F(xiàn)在常用基因攜帶載體主要有病毒載體和非病毒載體，病毒載體主要有腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，而逆轉(zhuǎn)錄病毒的堿基容納較少，體外獲得到的感染滴度較低；非病毒載體應(yīng)用較多的是質(zhì)粒載體，質(zhì)粒載體對(duì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率較低且毒性較高；因此本研究采用的是重組腺病毒載體，本研究結(jié)果表明重組腺病毒載體在攜帶較多堿基時(shí)仍能在體外獲得高感染滴度，MOI為 150時(shí)對(duì) BMSCs的感染效率可大于90%，同時(shí)通過倒置顯微鏡形態(tài)觀察和MTT比色法檢測(cè)均證實(shí)重組腺病毒對(duì) BMSCs的增殖能力不受影響；誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)也表明，感染了重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs仍保持良好的誘導(dǎo)分化神經(jīng)元細(xì)胞功能。

HSV1-TK報(bào)告基因系統(tǒng)的各種底物中，F(xiàn)AU通過擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，如細(xì)胞內(nèi)存在 HSV1-TK，F(xiàn)AU被磷酸化滯留于細(xì)胞內(nèi)，可以通過體外探測(cè)技術(shù)在活體上檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，而無磷酸化的FAU則很快排除細(xì)胞，隨著泌尿系統(tǒng)的分泌排泄，組織和血液中的FAU水平下降，具有較高的靈敏度和特異性[1,5]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)采用Idogen固相氧化法對(duì)FAU進(jìn)行射性碘標(biāo)記是一種簡(jiǎn)單的標(biāo)記方法，經(jīng)過Sep-Pak C18反相色譜柱，可以得到較高放射化學(xué)純度[5]。本研究結(jié)果表明攜帶 HSV1-TK報(bào)告基因的重組腺病毒感染BMSCs后，對(duì)131I-FIAU有較強(qiáng)攝取，在觀察時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)攝取率升高，感染組攝取率明顯高于對(duì)照組攝取率，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示攜帶報(bào)告基因TK的重組腺病毒載體感染BMSCs，可以表達(dá)有活性的酶，將131I-FIAU磷酸化而滯留于細(xì)胞，提示HSV1-TK/FIAU報(bào)告基因系統(tǒng)可用于活體動(dòng)態(tài)示蹤干細(xì)胞移植治療腦梗死。

綜上所述，重組腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNFEGFP可高效感染 BMSCs，IRES介導(dǎo)的兩目的基因可同時(shí)表達(dá)且有良好線性相關(guān)，感染 BMSCs仍保持良好的增殖和誘導(dǎo)分化神經(jīng)元細(xì)胞能力，并且能表達(dá)具有活性的激酶，使131I-FIAU磷酸化并有效滯留在細(xì)胞內(nèi)用于體外探測(cè)，這為活體報(bào)告基因顯像示蹤轉(zhuǎn)基因 BMSCS治療腦梗死奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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