改良硝酸脫鈣方法的研究及應用

劉憲軍 陳萍 徐林娜

在常規(guī)的病理技術工作中，經(jīng)常會遇到骨、牙齒及其他鈣化組織需要做石蠟切片及蘇木素-伊紅（HE）染色，做一張好切片，難度很大。優(yōu)良的脫鈣是做好石蠟切片及病理正確診斷的保證。硝酸是病理科最常用的脫鈣劑之一，它是借助使組織軟化并達到一定硬度后再做石蠟切片的一種方法。脫鈣的質(zhì)量受多種因素影響，硝酸的濃度、溫度是脫鈣效果的關鍵。我們根據(jù)微波(microwave,MW)輻射效應的原理[1-3]，選用了“低溫微波-硝酸快速脫鈣”方法對骨、牙齒及其他鈣化組織進行脫鈣，在HE染色實際應用中獲得了良好效果[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料 吉林市中心醫(yī)院病理科2006～2009年50例骨組織。JDIII型醫(yī)用微波爐。硝酸試劑為北京化工廠生產(chǎn)。

1.2 方法 將骨組織鋸成大小為1.5cm×1.5cm×0.15cm，用10%甲醛固定24h，流水沖洗15min～lh。實驗組采用“低溫微波-硝酸快速脫鈣”方法脫鈣，首先將硝酸在冰箱中預冷保持10℃，硝酸脫鈣液的濃度10%。(1)在1000ml的大燒杯內(nèi)放500ml冰水。(2)在500ml的小燒杯內(nèi)放250ml經(jīng)冰箱預冷的10%硝酸脫鈣液，然后放待脫鈣的組織。(3)將小燒杯放入大燒杯內(nèi)，然后一同放入微波爐中。(4)250W脫鈣,并測量大、小燒杯中液體的溫度。當接近10℃時，向大燒杯中添加冰塊，或向小燒杯中添加預冷的脫鈣液，這樣脫鈣液溫度不會迅速升高,又發(fā)揮了微波效應，保證了脫鈣液的溫度始終控制在15℃以內(nèi)，脫鈣時間骨密質(zhì)需要50～55min,骨松質(zhì)需要30～35min[7]。對照組采用室溫(20℃)硝酸,硝酸脫鈣液的濃度10%，脫鈣時間骨密質(zhì)需要24～36h,骨松質(zhì)需要12～24h，脫鈣后自來水沖洗4～6h[7]。實驗組和對照組脫鈣后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片數(shù)張，厚4μm，65℃烤片3h。將切片進行HE染色，對比觀察。

2 結果

圖1 HE×100

圖2 HE×100

實驗組中的骨組織及鈣化組織經(jīng)低溫微波-硝酸快速脫鈣方法過程處理后，一般可切出一張完整甚至連續(xù)、令人滿意的切片，HE染色后，顯微鏡下細胞核與細胞質(zhì)結構清晰，紅藍相間，色彩鮮艷（圖1），從切片質(zhì)量和染色等方面都明顯優(yōu)于對照組。對照組中的骨組織及鈣化的組織經(jīng)室溫(20℃)硝酸脫鈣液處理后，切片時刀片易產(chǎn)生缺口，制片不成型，厚薄不均，即使勉強切出片，質(zhì)量也很差，染色時易脫片，顯微鏡下細胞核不著藍色，而是與細胞質(zhì)等均為紅色，呈一片紅染(圖2)。所有這些都給病理醫(yī)生的診斷帶來困難。

3 討論

對骨及含鈣組織進行組織學觀察研究時，組織切片的制作是關鍵。但由于骨及含鈣組織硬，如果脫鈣不徹底可導致切片破碎甚至無法切片，因此組織制片前選擇合適的脫鈣液就顯得尤為重要。通常使用10%的硝酸水溶液對骨組織脫鈣，使骨組織中鈣鹽溶解于其中，然后用流水沖洗標本，需要的時間長，脫鈣不徹底，致使骨組織硬，難于得到完整的切片，即使勉強切出片，質(zhì)量也很差，染色時易脫片。如果經(jīng)過長時間脫鈣液處理后的組織，酸性太強，HE染色，顯微鏡下觀察細胞核不易著藍色，與細胞質(zhì)均為紅色，呈一片紅染，分不清細胞核的結構，所有這些切片都會給病理醫(yī)生的診斷帶來困難。根據(jù)實際工作經(jīng)驗，認為不能切出完整的切片，是因為脫鈣不徹底，組織過硬。HE染色不佳，是脫鈣液作用時間長，標本呈酸性，這些直接影響著染色效果，使細胞核、細胞質(zhì)等均染為紅色。針對這些問題，為了得到一張高質(zhì)量的含鈣組織的HE切片，經(jīng)過多種硝酸脫鈣方法的實驗及處理，不斷摸索總結，從2006年至今，一共有50多例骨組織，使用低溫微波-硝酸快速脫鈣方法脫鈣，此種方法脫鈣液對骨組織的滲透力強，作用時間短，對組織的結構損壞小，可以迅速和方便地軟化硬韌的骨組織、牙齒及其他鈣化組織，易于切取較好的組織切片，又能更好保存細胞結構，解決標本因浸泡脫鈣液時間過長，而使細胞核難于著色的問題，得到滿意的結果。這種脫鈣方法，不僅操作簡單，而且經(jīng)濟實用，效果滿意，值得推廣，對常規(guī)HE制片極其重要。經(jīng)多次實驗，無論切片的質(zhì)量，還是HE染色效果，此方法優(yōu)于常規(guī)硝酸脫鈣處理的方法，提高了切片與染色的質(zhì)量，最大程度地保存了細胞內(nèi)蛋白質(zhì)及酶等的結構，這對腫瘤的鑒別診斷，進一步做免疫組織化學染色及酶染色非常重要[8]，而且提高診斷的質(zhì)量和縮短發(fā)報告的時間。

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