舒芬太尼對培養(yǎng)大鼠乳鼠缺氧心肌細(xì)胞損傷保護作用的研究1)

王麗麗,趙建力,劉保江

舒芬太尼屬于純μ受體激動藥,在作用效應(yīng)、受體親和力、脂溶性、藥代動力學(xué)及血流動力學(xué)穩(wěn)定方面都有較大優(yōu)勢[1],舒芬太尼作為強效麻醉性鎮(zhèn)痛藥,已經(jīng)逐步取代芬太尼用于麻醉及鎮(zhèn)痛[2]。本課題選用氰化鈉造成培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧(細(xì)胞內(nèi)缺氧)模型,排除了血流動力學(xué)及其他因素在缺氧損傷的影響,研究舒芬太尼對細(xì)胞缺氧損傷的直接作用,從而提示舒芬太尼對機體的非麻醉作用即抗損傷作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生的SD大鼠(2～3)月16只～20只(由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。

1.2 主要試劑和器材 舒芬太尼(批號080506,湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司)、D-Hank液、四唑鹽(MTT)、EM EM(Dulbecco'smodified Eaglemedium,美國Sigma公司)、胰蛋白酶、多聚賴氨酸(華美生物工作公司進(jìn)口分裝)、氰化鈉(山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室)、超凈室、相差顯微鏡、JEOL-100CX型透射電鏡。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)[3,4]將乳鼠麻醉后消毒,斷頸處死,開胸取心臟置于培養(yǎng)皿中,用含抗生素的D-Hank液沖洗兩遍,去心包膜和大血管,剪成碎泥狀,移入50 m L離心管,0.125%的胰蛋白酶37℃水浴中消化15 m in,如此重復(fù)5次～7次,使組織塊消化完全,將第一次的細(xì)胞懸液棄去,收集以后的細(xì)胞懸液經(jīng)120目尼龍網(wǎng)過濾至含胰蛋白酶終止液(小牛血清)的50 m L離心管中,離心機1 000 r/min離心10m in,棄上清液,加入培養(yǎng)液(80%DMEM,10%小牛血清,10%胎牛血清,100 kU/L青霉素,100 k U/L鏈霉素)混懸,臺盼藍(lán)染色計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L。移至培養(yǎng)瓶中,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h以純化心肌細(xì)胞(反復(fù)貼壁法)然后接種到預(yù)先涂有0.01 g/L多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),2 d后換掉2/3液,以后按每72 h換液一次,每次換液一半。

1.4 抗缺氧實驗[5]取培養(yǎng)6 d～8 d整孔搏動相鄰的兩列(每列8孔)細(xì)胞,將緊鄰的兩孔隨機分成對照組及suf1組(缺氧+0.1 ng/m L舒芬太尼),C組為suf 2組(缺氧+0.2 ng/m L舒芬太尼)。將舒芬太尼(0.1 ng/m L、0.2 ng/m L)分別加入su f 1組、su f 2組;對照組給予等量的DM EM。37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,四唑鹽(MTT)微量自動比色A值,然后兩組均給予終濃度為1mmol/L的氰化鈉造成細(xì)胞內(nèi)缺氧,分別在缺氧12 h、24 h測定各組的A值,兩組實驗同時進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)空泡、顆粒及細(xì)胞膜偽足的變化。將每組的各孔細(xì)胞用刮勺刮取離心固定,切片染色,透射電鏡觀察。

1.6 MTT微量自動比色方法[6]于96孔板每孔內(nèi)加入50 μL M TT液(1.5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,以0.08 mmol/L鹽酸異丙醇100μL中止反應(yīng),酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定每孔A值(測定波長595 nm,參考波長655 nm)。無細(xì)胞孔做空白(Blank)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)24 h后,大部分細(xì)胞已貼壁,貼壁細(xì)胞呈不規(guī)則圓形,折光性強,胞體飽滿,周圍有一圈光暈。培養(yǎng)3 d后,大部分細(xì)胞已搏動,頻率為90/m in～120/m in,并且連成片狀呈細(xì)胞簇狀搏動。此時細(xì)胞融合成簇狀,肌纖維明顯,6 d后交織成網(wǎng)狀,搏動有力。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 ①倒置顯微鏡觀察,對照組心肌細(xì)胞在處理即時,形態(tài)未見明顯變化;在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,大部分細(xì)胞體腫脹,失去折光性,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒;缺氧24 h后,心肌細(xì)胞體出現(xiàn)明顯腫脹,顆粒增多,部分細(xì)胞胞膜破裂。su f 1組、su f 2組心肌細(xì)胞在處理即時,形態(tài)未見明顯變化;在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,大部分細(xì)胞腫脹,內(nèi)有顆粒,細(xì)胞膜完整;缺氧24 h后,腫脹明顯,胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多,失去折光性。②電鏡觀察,對照組缺氧培養(yǎng)12 h后,線粒體腫脹明顯,嵴破裂,空泡變,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張部分空泡形成;培養(yǎng)24 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張斷裂成大小不等的片段和小泡,細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重,可見到線粒體嚴(yán)重?fù)p傷形成的髓鞘樣結(jié)構(gòu)(myelin figure)。suf 1組、su f 2組缺氧培養(yǎng)12 h后,可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,線粒體腫脹,嵴明顯,雙層膜可見;培養(yǎng)24 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、斷裂,線粒體腫脹明顯,嵴破裂,膜模糊甚至消失,線粒體腫脹空泡變,胞漿內(nèi)有大水泡狀結(jié)構(gòu)。

2.3 抗缺氧實驗(見表1)

表1 各組缺氧前后心肌細(xì)胞A值比較(±s)

表1 各組缺氧前后心肌細(xì)胞A值比較(±s)

組別n A值比值對照組 缺氧前8 0.342±0.036缺氧后12 h 8 0.281±0.013 Su f 1組 缺氧前8 0.372±0.021缺氧后12 h 8 0.331±0.0111)Su f 2組 缺氧前8 0.309±0.012缺氧后12 h 8 0.321±0.041)缺氧后24 h 8 0.279±0.0371)與對照組比較,1)P＜0.05

3 討 論

機體的缺氧表現(xiàn)多樣化,并不處于恒定的缺氧狀態(tài),循環(huán)系統(tǒng)、白細(xì)胞等多種因素都參與到此過程。為達(dá)到實驗的可控性及實驗的單因素分析,采用心肌細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)心肌細(xì)胞,氰化鈉引起細(xì)胞缺氧損傷來進(jìn)行實驗。

研究表明MTT可被活細(xì)胞吸收,并在線粒體內(nèi)還原成藍(lán)色,用ELISA法測定培養(yǎng)液中甲的A值,可反映活細(xì)胞數(shù)量及琥珀酸呼吸鏈的狀態(tài)。本研究結(jié)果表明su f 1組、su f 2組在缺氧的12 h、24 h所測A值均明顯高于對照組,舒芬太尼對心肌細(xì)胞缺氧損傷有一定的保護作用。

舒芬太尼對反應(yīng)氧化物代謝的影響及由此可能產(chǎn)生的藥理或毒理效應(yīng)尚未完全明確,舒芬太尼對反應(yīng)氧化物或自由基的形成和代謝的研究報道不一致[7]。對舒芬太尼保護心肌的機制有很多方面尚不清楚,本課題只是初步性了解了舒芬太尼的心肌保護作用。

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