枯草芽孢桿菌誘變株發(fā)酵羽毛工藝條件的研究

吉林工商學院 張 昕

禽類羽毛中含75%～85%的硬質(zhì)角蛋白，羽毛角蛋白中的氨基酸大部分為疏水性氨基酸，其中胱氨酸二硫鍵很難被蛋白質(zhì)水解酶打開，使羽毛角蛋白性質(zhì)極其穩(wěn)定，在稀酸、稀堿溶液中不易水解，如果僅靠動物自身消化道中的消化酶基本上無法將其消化吸收。因此，要利用家禽羽毛作飼料，必須經(jīng)過一定的處理。目前國內(nèi)外現(xiàn)有的羽毛加工方法有：酸（堿）水解法、高溫高壓水解法、膨化法、酶法?，F(xiàn)有的物理、化學加工方法效果不理想，直接加入酶制劑的方法成本太高。生物發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)在處于研究階段，在生產(chǎn)實際中的應用鮮見報道（蔡成崗和鄭曉冬，2006；吳小倫等，2001）。因此，筆者通過多年研究，對枯草芽孢桿菌進行紫外線和亞硝酸鈉復合誘變，篩選出產(chǎn)角蛋白酶活力強的誘變菌株FUN 30.2，本試驗優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)生物降解羽毛粉提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 菌種 枯草芽孢桿菌紫外線和亞硝酸鈉復合誘變菌株FUN 30.2（實驗室保留的誘變種）。

1.2 培養(yǎng)基 優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基成分：羽毛粉5.5%，青貯玉米秸稈粉0.8%，K+濃度0.018 mol/L，Mg2+濃度 0.065 mol/L，Ca2+濃度 0.072 mol/L，F(xiàn)e2+濃度 0.010 mol/L，Na+濃度 0.088 mol/L。 pH：7.0 ～8.0。

2 試驗方法

2.1 菌種培養(yǎng)及酶活力測定方法

2.1.1 菌種培養(yǎng)方法 培養(yǎng)18 h的斜面菌種轉(zhuǎn)接到50 mL牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基中，（36±1）℃培養(yǎng) 18 h。

2.1.2 酶活力測定方法 發(fā)酵液過濾離心后，取其上清液 1 mL，加 2 mL Tris-HCl buffer（50 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0），然后加入 10 mg 羽毛粉，置于40℃水浴保溫振蕩反應6 h，然后加入2 mL 10%TCA終止反應。30 min后，4℃離心15 min，離心機轉(zhuǎn)速為8000 r/min，上清液于280 nm處測定OD值。對照試驗先加TCA終止液，其他試驗過程同上（張寒俊等，2004）。

酶活力定義為：以試驗組與對照組在280 nm處測定的吸光度OD值的差值表示，吸光度值每增加1所需的酶量為1 U。

羽毛角蛋白降解率=（加入羽毛粉干重-發(fā)酵后濾渣干重）/加入羽毛粉干重×100%。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗設計 選擇對微生物生長繁殖及產(chǎn)酶有影響的7因素16水平，以菌體產(chǎn)生的角蛋白酶 活力為響應值，F(xiàn)e2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、青貯玉米秸稈粉和羽毛粉加入量為因變量，對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，采用U*16（1610）使用表設計和安排試驗。

三角瓶中裝液量150 mL/500 mL，接種量5%， 搖床轉(zhuǎn)數(shù) 150 r/min，（36±1）℃恒溫搖床培養(yǎng)48 h，取上清液過濾離心，離心機轉(zhuǎn)速為8000 r/min，4℃離心15 min取上清液測定酶活力。

2.3 菌株發(fā)酵及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗 通過測定不同發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌誘變種產(chǎn)酶的酶活力來優(yōu)化發(fā)酵條件，為工業(yè)化生產(chǎn)生物降解羽毛粉提供工藝參數(shù)。

2.3.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 配制均勻設計的優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，分別在設定溫度的搖床里進行發(fā)酵，其他發(fā)酵條件為，培養(yǎng)基裝液量150 mL/500 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min發(fā)酵48 h，接種量為5%（V/V），發(fā)酵結(jié)束后分別測定酶活力。

2.3.2 接種量的優(yōu)化 分別以設定的接種量，在優(yōu)化的溫度下發(fā)酵48 h后測定酶活力。

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 設定不同的搖床轉(zhuǎn)速，在上面試驗中確定的溫度和接種量條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵48 h結(jié)束后分別測定酶活力。

2.3.4 發(fā)酵液裝液量的優(yōu)化 分別設定發(fā)酵液的裝液量，在前面試驗確定的條件下發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后測定酶活力。

2.3.5 發(fā)酵液初始pH值的優(yōu)化 初始pH值對菌體生長的影響：配制完全培養(yǎng)基，把培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)到 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。其他發(fā)酵條件為優(yōu)化后的條件，24 h發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)液用無菌生理鹽水稀釋10倍，于660 nm測定吸光度值。

初始pH值對菌體產(chǎn)酶的影響：配制均勻設計優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，把培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)到 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。 其他發(fā)酵條件為優(yōu)化后的條件，48 h發(fā)酵結(jié)束后分別測定酶活力。

2.3.6 培養(yǎng)時間的優(yōu)化 培養(yǎng)時間對菌體細胞生長的影響：配制優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，設定不同培養(yǎng)時間，每隔6 h測定一瓶發(fā)酵液中活細胞數(shù)。

培養(yǎng)時間對菌體產(chǎn)酶的影響：配制優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，設定不同培養(yǎng)時間，每隔6 h測定一瓶發(fā)酵液的酶活力及羽毛降解率。

3 結(jié)果與分析

3.1 顯微鏡觀察結(jié)果 見圖1和圖2。

圖1 顯微鏡下觀察未降解羽毛粉

圖2 顯微鏡下觀察已降解羽毛粉

3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗結(jié)果 見表1。

由表1可見，條件（6）菌體產(chǎn)生的角蛋白酶活力高達1.117 U/mL，所以選擇優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基成分配比為：羽毛粉5.5%，青貯玉米秸稈粉0.8%，K+濃度 0.018 mol/L，Mg2+濃度 0.065 mol/L，Ca2+濃度 0.072 mol/L，F(xiàn)e2+濃度 0.010 mol/L，Na+濃度0.088 mol/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基之前，測定菌體角蛋白酶活力為0.889 U/mL；培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌體產(chǎn)酶活力提高了25.65%。

表1 各因素水平的角蛋白酶活力測定結(jié)果

3.3 菌株發(fā)酵及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗結(jié)果

圖3 發(fā)酵溫度對菌體產(chǎn)酶活力的影響

3.3.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 見圖3。由圖3可見，溫度為27～33℃時，隨著溫度的升高，酶活力明顯提高，超過33℃以后，隨著溫度的升高酶活力下降。FUN 30.2菌株在33℃發(fā)酵，酶活最高達到了1.121 U/mL。因此選擇最佳發(fā)酵溫度為33℃。比誘變前菌體生長的適宜溫度略低。

3.3.2 接種量的優(yōu)化 見圖4。

圖4 接種量對發(fā)酵過程中酶活力的影響

由圖4可見，接種量對菌體降解角蛋白的能力影響不大，適當增加接菌量，可以縮短發(fā)酵的適應期，減少雜菌污染的幾率。接種量從2%增加到6%，酶活力呈上升趨勢，接種量從6%增加到9%，酶活力變化不明顯，因此確定接種量為6%。

3.3.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 見圖5。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對菌體產(chǎn)酶活力的影響

由圖5可見，搖床轉(zhuǎn)速直接影響發(fā)酵液中的溶氧，搖床轉(zhuǎn)速從90 r/min升到170 r/min，酶活力隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高而明顯增加，超過170 r/min后，酶活力變化不大。確定搖床轉(zhuǎn)速170 r/min。

3.3.4 發(fā)酵液裝液量的優(yōu)化 見圖6。

圖6 裝液量對發(fā)酵過程中酶活力的影響

由圖6可見，裝液量加大，發(fā)酵液的酶活力明顯降低。裝液較多影響了發(fā)酵液中的溶氧，從而影響菌體的正常生長。裝液量在100 mL時，發(fā)酵液酶活力最大。最大值為1.163 U/mL，確定最適合的裝液量為100 mL/500 mL。

3.3.5 發(fā)酵液初始pH值的優(yōu)化

3.3.5.1 初始pH值對菌體生長的影響：見圖7。

圖7 發(fā)酵液初始pH值對菌體生長的影響

由圖7可見，菌體生長適宜的培養(yǎng)基初始pH值范圍是6.5～7.5，最適pH值為7.0。

3.3.5.2 初始pH值對菌體產(chǎn)酶的影響：見圖8。

圖8 發(fā)酵液初始pH值對菌體產(chǎn)酶活力的影響

由圖8可見，pH值為5.5～7.5時，酶活力迅速增大，pH值為7.5時酶活力達到高峰，pH值大于8.0時，酶活力逐漸下降，選擇菌體產(chǎn)酶的發(fā)酵液最適宜pH值為7.5～8.0。

3.3.6 培養(yǎng)時間的優(yōu)化 見圖9。

圖9 發(fā)酵液中的活細胞生長曲線

由圖9可見，培養(yǎng)時間對菌體細胞生長的影響：培養(yǎng)時間0～18 h，菌體處于適應期，培養(yǎng)時間18～36 h，菌體處于對數(shù)期，培養(yǎng)時間36～54 h，菌體處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)時間54 h后，菌體處于衰亡期。從菌體的生長曲線分析，在以羽毛和玉米秸稈為碳、氮源的培養(yǎng)基中，菌體的適應期較長，可能是細胞進行代謝的調(diào)整，包括誘導酶的產(chǎn)生，據(jù)資料報道，角蛋白酶是誘導酶，這可能與菌體的適應期較長有關(guān)。

培養(yǎng)時間對菌體細胞產(chǎn)酶活力的影響：由圖10可見，每隔6 h測定一瓶優(yōu)化羽毛粉發(fā)酵液的酶活力及羽毛降解率。發(fā)酵時間從0～60 h，菌體的酶活力不斷上升，其中24～60 h菌體酶活力的提高較快，60 h菌體酶活力最高達1.267 U/mL；60 h以后酶活力迅速下降，90 h以后酶活力略有回升趨勢，可能與菌體生長及發(fā)酵液的pH值變化有關(guān)。同時，羽毛降解率在持續(xù)上升，36～72 h階段羽毛降解率上升較快，72 h降解率已經(jīng)達到了69.61%，72 h以后降解率變化不明顯。綜合分析發(fā)酵過程中酶活力和羽毛降解率的變化規(guī)律，選擇最佳發(fā)酵時間為72 h。

圖10 發(fā)酵時間對酶活力和羽毛降解率的影響

3.4 發(fā)酵液氨基酸含量測定 由吉林大學測試中心測定，結(jié)果見表2。

表2 羽毛粉發(fā)酵液的氨基酸含量測定結(jié)果mg/mL

4 結(jié)論

4.1 羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗結(jié)果表明，該菌株最佳羽毛培養(yǎng)基成分配比為：羽毛粉5.5%，青貯玉米秸稈粉 0.8%，K+濃度 0.018 mol/L，Mg2+濃度0.065 mol/L，Ca2+濃 度 0.072 mol/L，F(xiàn)e2+濃 度0.010 mol/L，Na+濃度 0.088 mol/L。培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌體產(chǎn)酶活力提高了25.65%。

4.2 應用單因子試驗設計法對影響菌株發(fā)酵過程的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度33℃，培養(yǎng)時間72 h，搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，接種量 6%，裝液量 100 mL/500 mL，菌體生長適宜的培養(yǎng)基初始pH值范圍是7.0左右，菌體產(chǎn)酶的發(fā)酵液最適宜pH值為7.5～8.0。在培養(yǎng)時間因素試驗中，發(fā)酵液中活細胞數(shù)在48 h達到高峰，為3.9×109CFU/mL；60 h菌體產(chǎn)酶活力最高達1.267 U/mL；在發(fā)酵時間達到72 h時，羽毛降解率達到了69.61%。

3.5.3 經(jīng)該菌株發(fā)酵，羽毛角蛋白大量轉(zhuǎn)化為氨基酸、短肽和菌體蛋白，發(fā)酵液的氨基酸含量高達22.66 mg/mL。

[1]蔡成崗，鄭曉冬.角蛋白酶的來源、理化性質(zhì)與生物工程研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（4）：111 ～ 113.

[2]吳小倫，閔航，馬曉航.羽毛角蛋白的生物降解 [J].環(huán)境污染與防治2001，23（1）：66 ～ 68.

[3]張寒俊，劉大川，楊國燕.紫外光譜法定量測定不同種蛋白酶活力的研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2004，9：44 ～ 45.