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    枯草芽孢桿菌誘變株發(fā)酵羽毛工藝條件的研究

    2010-06-29 10:26:36吉林工商學(xué)院
    中國(guó)飼料 2010年3期
    關(guān)鍵詞:優(yōu)化

    吉林工商學(xué)院 張 昕

    禽類羽毛中含75%~85%的硬質(zhì)角蛋白,羽毛角蛋白中的氨基酸大部分為疏水性氨基酸,其中胱氨酸二硫鍵很難被蛋白質(zhì)水解酶打開,使羽毛角蛋白性質(zhì)極其穩(wěn)定,在稀酸、稀堿溶液中不易水解,如果僅靠動(dòng)物自身消化道中的消化酶基本上無法將其消化吸收。因此,要利用家禽羽毛作飼料,必須經(jīng)過一定的處理。目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的羽毛加工方法有:酸(堿)水解法、高溫高壓水解法、膨化法、酶法?,F(xiàn)有的物理、化學(xué)加工方法效果不理想,直接加入酶制劑的方法成本太高。生物發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)在處于研究階段,在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用鮮見報(bào)道(蔡成崗和鄭曉冬,2006;吳小倫等,2001)。因此,筆者通過多年研究,對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變,篩選出產(chǎn)角蛋白酶活力強(qiáng)的誘變菌株FUN 30.2,本試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件,為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)生物降解羽毛粉提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 菌種 枯草芽孢桿菌紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變菌株FUN 30.2(實(shí)驗(yàn)室保留的誘變種)。

    1.2 培養(yǎng)基 優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基成分:羽毛粉5.5%,青貯玉米秸稈粉0.8%,K+濃度0.018 mol/L,Mg2+濃度 0.065 mol/L,Ca2+濃度 0.072 mol/L,F(xiàn)e2+濃度 0.010 mol/L,Na+濃度 0.088 mol/L。 pH:7.0 ~8.0。

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 菌種培養(yǎng)及酶活力測(cè)定方法

    2.1.1 菌種培養(yǎng)方法 培養(yǎng)18 h的斜面菌種轉(zhuǎn)接到50 mL牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基中,(36±1)℃培養(yǎng) 18 h。

    2.1.2 酶活力測(cè)定方法 發(fā)酵液過濾離心后,取其上清液 1 mL,加 2 mL Tris-HCl buffer(50 mmol/L Tris-HCI,pH 8.0),然后加入 10 mg 羽毛粉,置于40℃水浴保溫振蕩反應(yīng)6 h,然后加入2 mL 10%TCA終止反應(yīng)。30 min后,4℃離心15 min,離心機(jī)轉(zhuǎn)速為8000 r/min,上清液于280 nm處測(cè)定OD值。對(duì)照試驗(yàn)先加TCA終止液,其他試驗(yàn)過程同上(張寒俊等,2004)。

    酶活力定義為:以試驗(yàn)組與對(duì)照組在280 nm處測(cè)定的吸光度OD值的差值表示,吸光度值每增加1所需的酶量為1 U。

    羽毛角蛋白降解率=(加入羽毛粉干重-發(fā)酵后濾渣干重)/加入羽毛粉干重×100%。

    2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶有影響的7因素16水平,以菌體產(chǎn)生的角蛋白酶 活力為響應(yīng)值,F(xiàn)e2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、青貯玉米秸稈粉和羽毛粉加入量為因變量,對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,采用U*16(1610)使用表設(shè)計(jì)和安排試驗(yàn)。

    三角瓶中裝液量150 mL/500 mL,接種量5%, 搖床轉(zhuǎn)數(shù) 150 r/min,(36±1)℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h,取上清液過濾離心,離心機(jī)轉(zhuǎn)速為8000 r/min,4℃離心15 min取上清液測(cè)定酶活力。

    2.3 菌株發(fā)酵及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗(yàn) 通過測(cè)定不同發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌誘變種產(chǎn)酶的酶活力來優(yōu)化發(fā)酵條件,為工業(yè)化生產(chǎn)生物降解羽毛粉提供工藝參數(shù)。

    2.3.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 配制均勻設(shè)計(jì)的優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基,分別在設(shè)定溫度的搖床里進(jìn)行發(fā)酵,其他發(fā)酵條件為,培養(yǎng)基裝液量150 mL/500 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min發(fā)酵48 h,接種量為5%(V/V),發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定酶活力。

    2.3.2 接種量的優(yōu)化 分別以設(shè)定的接種量,在優(yōu)化的溫度下發(fā)酵48 h后測(cè)定酶活力。

    2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 設(shè)定不同的搖床轉(zhuǎn)速,在上面試驗(yàn)中確定的溫度和接種量條件下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵48 h結(jié)束后分別測(cè)定酶活力。

    2.3.4 發(fā)酵液裝液量的優(yōu)化 分別設(shè)定發(fā)酵液的裝液量,在前面試驗(yàn)確定的條件下發(fā)酵48 h,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酶活力。

    2.3.5 發(fā)酵液初始pH值的優(yōu)化 初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響:配制完全培養(yǎng)基,把培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)到 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。其他發(fā)酵條件為優(yōu)化后的條件,24 h發(fā)酵結(jié)束后,培養(yǎng)液用無菌生理鹽水稀釋10倍,于660 nm測(cè)定吸光度值。

    初始pH值對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響:配制均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基,把培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)到 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。 其他發(fā)酵條件為優(yōu)化后的條件,48 h發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定酶活力。

    2.3.6 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:配制優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基,設(shè)定不同培養(yǎng)時(shí)間,每隔6 h測(cè)定一瓶發(fā)酵液中活細(xì)胞數(shù)。

    培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響:配制優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基,設(shè)定不同培養(yǎng)時(shí)間,每隔6 h測(cè)定一瓶發(fā)酵液的酶活力及羽毛降解率。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 顯微鏡觀察結(jié)果 見圖1和圖2。

    圖1 顯微鏡下觀察未降解羽毛粉

    圖2 顯微鏡下觀察已降解羽毛粉

    3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 見表1。

    由表1可見,條件(6)菌體產(chǎn)生的角蛋白酶活力高達(dá)1.117 U/mL,所以選擇優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基成分配比為:羽毛粉5.5%,青貯玉米秸稈粉0.8%,K+濃度 0.018 mol/L,Mg2+濃度 0.065 mol/L,Ca2+濃度 0.072 mol/L,F(xiàn)e2+濃度 0.010 mol/L,Na+濃度0.088 mol/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基之前,測(cè)定菌體角蛋白酶活力為0.889 U/mL;培養(yǎng)基優(yōu)化后,菌體產(chǎn)酶活力提高了25.65%。

    表1 各因素水平的角蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

    3.3 菌株發(fā)酵及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

    圖3 發(fā)酵溫度對(duì)菌體產(chǎn)酶活力的影響

    3.3.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 見圖3。由圖3可見,溫度為27~33℃時(shí),隨著溫度的升高,酶活力明顯提高,超過33℃以后,隨著溫度的升高酶活力下降。FUN 30.2菌株在33℃發(fā)酵,酶活最高達(dá)到了1.121 U/mL。因此選擇最佳發(fā)酵溫度為33℃。比誘變前菌體生長(zhǎng)的適宜溫度略低。

    3.3.2 接種量的優(yōu)化 見圖4。

    圖4 接種量對(duì)發(fā)酵過程中酶活力的影響

    由圖4可見,接種量對(duì)菌體降解角蛋白的能力影響不大,適當(dāng)增加接菌量,可以縮短發(fā)酵的適應(yīng)期,減少雜菌污染的幾率。接種量從2%增加到6%,酶活力呈上升趨勢(shì),接種量從6%增加到9%,酶活力變化不明顯,因此確定接種量為6%。

    3.3.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 見圖5。

    圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體產(chǎn)酶活力的影響

    由圖5可見,搖床轉(zhuǎn)速直接影響發(fā)酵液中的溶氧,搖床轉(zhuǎn)速?gòu)?0 r/min升到170 r/min,酶活力隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高而明顯增加,超過170 r/min后,酶活力變化不大。確定搖床轉(zhuǎn)速170 r/min。

    3.3.4 發(fā)酵液裝液量的優(yōu)化 見圖6。

    圖6 裝液量對(duì)發(fā)酵過程中酶活力的影響

    由圖6可見,裝液量加大,發(fā)酵液的酶活力明顯降低。裝液較多影響了發(fā)酵液中的溶氧,從而影響菌體的正常生長(zhǎng)。裝液量在100 mL時(shí),發(fā)酵液酶活力最大。最大值為1.163 U/mL,確定最適合的裝液量為100 mL/500 mL。

    3.3.5 發(fā)酵液初始pH值的優(yōu)化

    3.3.5.1 初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響:見圖7。

    圖7 發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

    由圖7可見,菌體生長(zhǎng)適宜的培養(yǎng)基初始pH值范圍是6.5~7.5,最適pH值為7.0。

    3.3.5.2 初始pH值對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響:見圖8。

    圖8 發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌體產(chǎn)酶活力的影響

    由圖8可見,pH值為5.5~7.5時(shí),酶活力迅速增大,pH值為7.5時(shí)酶活力達(dá)到高峰,pH值大于8.0時(shí),酶活力逐漸下降,選擇菌體產(chǎn)酶的發(fā)酵液最適宜pH值為7.5~8.0。

    3.3.6 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 見圖9。

    圖9 發(fā)酵液中的活細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

    由圖9可見,培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:培養(yǎng)時(shí)間0~18 h,菌體處于適應(yīng)期,培養(yǎng)時(shí)間18~36 h,菌體處于對(duì)數(shù)期,培養(yǎng)時(shí)間36~54 h,菌體處于穩(wěn)定期,培養(yǎng)時(shí)間54 h后,菌體處于衰亡期。從菌體的生長(zhǎng)曲線分析,在以羽毛和玉米秸稈為碳、氮源的培養(yǎng)基中,菌體的適應(yīng)期較長(zhǎng),可能是細(xì)胞進(jìn)行代謝的調(diào)整,包括誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生,據(jù)資料報(bào)道,角蛋白酶是誘導(dǎo)酶,這可能與菌體的適應(yīng)期較長(zhǎng)有關(guān)。

    培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)酶活力的影響:由圖10可見,每隔6 h測(cè)定一瓶?jī)?yōu)化羽毛粉發(fā)酵液的酶活力及羽毛降解率。發(fā)酵時(shí)間從0~60 h,菌體的酶活力不斷上升,其中24~60 h菌體酶活力的提高較快,60 h菌體酶活力最高達(dá)1.267 U/mL;60 h以后酶活力迅速下降,90 h以后酶活力略有回升趨勢(shì),可能與菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵液的pH值變化有關(guān)。同時(shí),羽毛降解率在持續(xù)上升,36~72 h階段羽毛降解率上升較快,72 h降解率已經(jīng)達(dá)到了69.61%,72 h以后降解率變化不明顯。綜合分析發(fā)酵過程中酶活力和羽毛降解率的變化規(guī)律,選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

    圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活力和羽毛降解率的影響

    3.4 發(fā)酵液氨基酸含量測(cè)定 由吉林大學(xué)測(cè)試中心測(cè)定,結(jié)果見表2。

    表2 羽毛粉發(fā)酵液的氨基酸含量測(cè)定結(jié)果mg/mL

    4 結(jié)論

    4.1 羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌株最佳羽毛培養(yǎng)基成分配比為:羽毛粉5.5%,青貯玉米秸稈粉 0.8%,K+濃度 0.018 mol/L,Mg2+濃度0.065 mol/L,Ca2+濃 度 0.072 mol/L,F(xiàn)e2+濃 度0.010 mol/L,Na+濃度 0.088 mol/L。培養(yǎng)基優(yōu)化后,菌體產(chǎn)酶活力提高了25.65%。

    4.2 應(yīng)用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)影響菌株發(fā)酵過程的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到最優(yōu)的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度33℃,培養(yǎng)時(shí)間72 h,搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,接種量 6%,裝液量 100 mL/500 mL,菌體生長(zhǎng)適宜的培養(yǎng)基初始pH值范圍是7.0左右,菌體產(chǎn)酶的發(fā)酵液最適宜pH值為7.5~8.0。在培養(yǎng)時(shí)間因素試驗(yàn)中,發(fā)酵液中活細(xì)胞數(shù)在48 h達(dá)到高峰,為3.9×109CFU/mL;60 h菌體產(chǎn)酶活力最高達(dá)1.267 U/mL;在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到72 h時(shí),羽毛降解率達(dá)到了69.61%。

    3.5.3 經(jīng)該菌株發(fā)酵,羽毛角蛋白大量轉(zhuǎn)化為氨基酸、短肽和菌體蛋白,發(fā)酵液的氨基酸含量高達(dá)22.66 mg/mL。

    [1]蔡成崗,鄭曉冬.角蛋白酶的來源、理化性質(zhì)與生物工程研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(4):111 ~ 113.

    [2]吳小倫,閔航,馬曉航.羽毛角蛋白的生物降解 [J].環(huán)境污染與防治2001,23(1):66 ~ 68.

    [3]張寒俊,劉大川,楊國(guó)燕.紫外光譜法定量測(cè)定不同種蛋白酶活力的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2004,9:44 ~ 45.

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