黃曲霉毒素直接競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒的研制及其在花生和花生制品中的應(yīng)用

北京中檢維康技術(shù)有限公司 王 雄 王艷斐 果 旗 榮 釗 陳冰君

長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 王 麗

中國(guó)原子能科學(xué)研究院 吳繼宗

目前，黃曲霉毒素（AFT）的檢測(cè)方法主要有薄層層析法、色譜法和微管柱篩選法等 （張藝兵等，2006）。這些方法因精確度低、敏感性差；樣品前處理過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)；或需要價(jià)格昂貴的儀器，檢測(cè)成本高，難以推廣應(yīng)用，影響了飼料中黃曲霉毒素的有效監(jiān)測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是在免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種微量檢測(cè)技術(shù)，特別適合對(duì)黃曲霉毒素污染監(jiān)控中大量樣本的篩檢（路戈和計(jì)融，1996）。本研究以B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，以能分泌抗黃曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ)，建立了一種高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適用于大批量樣品篩選的定性、定量的用于檢測(cè)飼料中黃曲霉毒素的ELISA檢測(cè)方法。

1 基本原理

酶聯(lián)免疫法是以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的，以酶或者輔酶作為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原，用酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)最大的特點(diǎn)就是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板，吸附抗抗體，使之固相化，加樣品提取液和酶標(biāo)AFT抗原 （AFT與辣根過氧化物酶的結(jié)合物），在酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)。加底物（TMB）顯色，顏色的深淺取決于抗體和酶標(biāo)抗原的結(jié)合量。樣品中黃曲霉毒素多，則被抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原就少。在辣根過氧化物酶存在下，底物與其反應(yīng)，顯藍(lán)色，硫酸終止后顯黃色。用酶標(biāo)儀讀數(shù)，用專用軟件分析，即可得出黃曲霉毒素的含量。

2 材料與方法

2.1 儀器和試劑

2.1.1 主要儀器 酶標(biāo)分析儀 （Thermo Labsystems），高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），電子分析天平（Mettler Toledo），電熱恒溫培養(yǎng)箱 （天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；潔凈臺(tái)（天津科學(xué)儀器廠）；生物倒置顯微鏡（日本歐林巴斯光學(xué)株式會(huì)社）等。

2.1.2 試劑 抗黃曲霉毒素B1雜交瘤細(xì)胞株（北京中檢維康技術(shù)有限公司研制）；HRP標(biāo)記黃曲霉毒素（北京中檢維康技術(shù)有限公司研制）；黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、T-2毒素、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、牛血清白蛋白（BSA）、伏馬菌素B1等（均購(gòu)自Sigma公司）。

2.2 單克隆抗體制備 將抗黃曲霉毒素B1雜交瘤細(xì)胞注入BALB/c小鼠腹腔，獲得含抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體的腹水，并將所得腹水采用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化（路戈和計(jì)融，1996）。

2.3 抗體特性鑒定

2.3.1 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定 應(yīng)用間接ELISA法測(cè)定純化后的單克隆抗體的效價(jià)。判定標(biāo)準(zhǔn)：以腹水OD值除以SP2/0腹水OD值大于或等于2的最高稀釋倍數(shù)為腹水效價(jià)。

2.3.2 單克隆抗體特異性的測(cè)定 選擇嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、伏馬菌素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、牛血清白蛋白（BSA），將不同濃度上述毒素替代黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，應(yīng)用直接ELISA法測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出50%抑制濃度（IC50），并計(jì)算交叉反應(yīng)率。計(jì)算公式如下：

2.4 試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)研究

2.4.1 抗抗體與單抗、酶標(biāo)抗原最適工作濃度的確定 采用方陣法確定抗抗體、單抗及酶標(biāo)抗原的最適工作濃度，每板同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。判斷標(biāo)準(zhǔn)：選擇OD值在1.5左右時(shí)，包被抗抗體濃度、單抗以及酶標(biāo)抗原濃度為最適工作濃度。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，以無黃曲霉毒素抑制時(shí)的OD值為B0值相應(yīng)濃度黃曲霉毒素抑制時(shí)的OD值為B值，百分吸光度值（B/B0）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 實(shí)驗(yàn)方法

2.5.1 樣品前處理

2.5.1.1 稱取5 g樣品，加入25 mL樣品提取液（70%甲醇水），劇烈振蕩3 min（用手或振蕩器）。2.5.1.2 將提取液用普通濾紙過濾，取3 mL稀釋液加入3 mL正己烷，振蕩1 min，3000 r/min離心2 min去上層，取下層以稀釋緩沖液按1∶1的比例稀釋（吸取 500 μL 濾液，加入 500 μL 稀釋液緩沖液），該液為待測(cè)液。樣本稀釋倍數(shù)為10倍。

2.5.2 測(cè)定步驟

2.5.2.1 酶標(biāo)板的制備：以pH 7.2的磷酸鈉鹽緩沖溶液作為包被緩沖液，將抗體稀釋到最佳工作濃度，每孔加入200 μL，37℃溫育2 h或4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入200～250 μL 0.7%的明膠封閉液，37℃溫育1～2 h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁箔袋真空密封保存。

2.5.2.2 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2～8℃冷藏保存。

2.5.2.3 分別將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后再各加入稀釋后的酶標(biāo)抗原，最后加入稀釋后的抗體，加蓋，在37℃溫育10 min（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭）。

2.5.2.4 倒出孔中的液體，然后每孔加入洗滌液洗滌，重復(fù)操作4次，洗完后用力在吸水紙上拍干。

2.5.2.5 加入顯色液，37℃避光溫育15 min。

2.5.2.6 加入硫酸終止液，終止反應(yīng)。

2.5.3 結(jié)果判定 結(jié)果的判定方法：所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

以黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（μg/kg）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。

樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

2.5.4 回收率實(shí)驗(yàn) 根據(jù)試劑盒的檢測(cè)范圍確定加標(biāo)濃度，在不含黃曲霉毒素的三樣品中分別進(jìn)行 5、10、20 μg/kg 三個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平做4個(gè)重復(fù)的平行樣。樣品按照2.5.1提取方法進(jìn)行提取，待測(cè)液用ELISA進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對(duì)試劑盒穩(wěn)定性采用37℃加速破壞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，將試劑盒分別放置于4℃和37℃，每隔24 h進(jìn)行ELISA測(cè)定，測(cè)定陰性對(duì)照（不加毒素B0）和陽(yáng)性（即50%的抑制毒素濃度B）的吸光度（A）值，計(jì)算兩者的比值（B/B0）。 當(dāng) B0<0.6 個(gè)吸光度（A）值，或 B/B0<0.7A時(shí)，即可判定ELISA試劑盒已失效。在37℃放置24 h相當(dāng)于在4℃放置45 d。從試劑盒的生產(chǎn)日期到失效日期的時(shí)間可確定為ELISA試劑盒的穩(wěn)定周期，即保質(zhì)期。

3 結(jié)果分析

3.1 單克隆抗體特性鑒定 雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的腹水抗體經(jīng)純化后，抗體效價(jià)約為1∶30000，抗體的工作濃度為1∶20000。抗體與T-2毒素、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素B1等其他真菌毒素和牛血清白蛋白的交叉反應(yīng)均小于0.1%。

3.2 試劑盒技術(shù)參數(shù) 根據(jù)方陣法確定，抗體的最適工作濃度為1∶20000，黃曲霉羊抗鼠抗體的最適包被濃度為 1∶5000，酶標(biāo)抗體濃度為 1∶7000。標(biāo)準(zhǔn)曲線中黃曲霉毒素的濃度分別為 0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL， 最低檢出濃度是 0.5 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-7.5x+88.6，R=0.995，線性范圍為0.5～10.0 ng/mL，50%的抑制濃度為1.5 ng/mL左右。

3.3 回收率測(cè)定 對(duì)花生及制品做黃曲霉毒素的回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為 5、10、20 μg/kg。其加標(biāo)回收率的范圍為70%～110%，具體見表1。

表1 花生樣品中回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn) 經(jīng)37℃穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)，試劑盒能在37℃下存放150 h后，陰性對(duì)照吸光度值為0.75，仍然大于0.6。所以該試劑盒有效期能達(dá)到6個(gè)月。

4 討論

因?yàn)镋LISA是利用抗體的選擇性和標(biāo)記酶的化學(xué)放大的靈敏性建立起來的，故應(yīng)考慮的因素主要有以下幾方面（Richard 等，1994）：（1）抗體包被：將抗抗體固定在聚苯乙烯微量反應(yīng)板中稱為包被，包被的質(zhì)量是影響抗原、抗體反應(yīng)的重要因素。（2）非特異性反應(yīng)：ELISA中會(huì)發(fā)生許多非特異性反應(yīng)，嚴(yán)重干擾分析結(jié)果，選擇適合的抗原、抗體組合，可以明顯的減少這種反應(yīng)的發(fā)生。（3）酶和抗原的偶聯(lián)：酶和抗原偶聯(lián)的好壞，直接影響試劑靈敏度。本實(shí)驗(yàn)操作時(shí)采用的是辣根過氧化物酶與抗原偶聯(lián)CMO的方法。（4）底物：當(dāng)酶標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物與底物相遇時(shí)，復(fù)合物中的酶水解底物，是無色的底物溶液生成有色的反應(yīng)產(chǎn)物。因此，應(yīng)注意底物溶液的避光性。（5）洗滌：酶促反應(yīng)，每次反應(yīng)后都需反復(fù)洗滌，這既保證了反應(yīng)定量關(guān)系，也除去了血清中與反應(yīng)無關(guān)的其他成分及游離的復(fù)合物等。洗滌效果與檢測(cè)結(jié)果密切相關(guān)。如果洗滌不充分，常引起結(jié)果的紊亂，最好做到洗滌的步驟標(biāo)準(zhǔn)化。

5 小結(jié)

本研究在制備出針對(duì)黃曲霉毒素有較好的靈敏度，在特異性抗體和酶標(biāo)抗原基礎(chǔ)上，研制出對(duì)飼料中黃曲霉毒素的ELISA快速檢測(cè)試劑盒。該試劑盒最低檢出濃度為0.5 μg/kg，對(duì)樣品的檢測(cè)范圍為5.0～100 μg/kg，試劑盒所用單克隆抗體與其他真菌毒素均無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。對(duì)花生及花生粕做添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為70%～110%，重復(fù)性和再現(xiàn)性良好，在2～8℃條件下可以保存6個(gè)月。以上技術(shù)參數(shù)均達(dá)到試劑盒的技術(shù)要求，而且具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、特異性好，并可同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。

[1]路戈，計(jì)融.食品中黃曲霉毒素B1單克隆抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定方法的建立及初步應(yīng)用[J].衛(wèi)生研究，1996，5（3）：162 ～ 165.

[2]張藝兵，鮑蕾，禇慶華，等.農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.1～6.

[3]Richard J Cole，Joe W.Dorner.Extraction of aflatoxin from Naturally contaminated peanuts and solvent peanut rations[J].J AOAC，1994，77（6）：1509 ～1511.