PAI-1mRNA在糖尿病大鼠腎臟的表達與通心絡(luò)膠囊的干預(yù)作用研究1)

朱雄超,范 慧,余國友,鄭旭寧

糖尿病作為一個在當(dāng)今社會發(fā)病率劇增的代謝性疾病已引起人們?nèi)找嬖黾拥年P(guān)注,糖尿病的大血管及微血管病變包括糖尿病心血管并發(fā)癥,糖尿病腎病(DN),糖尿病神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變等是造成糖尿病病人病痛、生活質(zhì)量下降甚至致殘、死亡的原因,DN病人由于腎功能損害而必須透析治療者占透析病人的比例也明顯增高。纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是纖溶酶原激活物的專一性、快速性有效生理抑制劑,在體內(nèi)纖溶與抗纖溶系統(tǒng)的平衡調(diào)節(jié)中起重要作用,也因此與許多血栓性疾病包括糖尿病慢性大血管、微血管并發(fā)癥密切相關(guān)。但PAI-1與糖尿病的大血管病變方面的研究較多,其與DN的相關(guān)性研究開展不多。DN的發(fā)病機制未完全明確,已明確許多細胞因子如血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、內(nèi)皮素、血小板源生長因子等與DN密切相關(guān)[1]。近年國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn)PAI-1與DN密切相關(guān)[2]。本研究旨在了解PAI-1與DN的發(fā)生發(fā)展是否相關(guān),同時研究中藥通心絡(luò)對腎組織PAI-1的合成分泌是否有影響及從而是否對DN的發(fā)牛具有干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠 50只,清潔級動物,雌雄各半,體重201 g～237g(218.0g±10.32g),由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供實驗動物和標(biāo)準(zhǔn)實驗室。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型建立 用天平稱取鏈尿佐菌素450 mg,加入由檸檬酸、檸檬酸鈉配成pH值為4.2緩沖液37.5 mL,搖勻放置冰浴中。隨機抽取SD大鼠30只(雌雄各半),按60 mg/kg即0.5 mL/100 g在大鼠腹腔注射鏈尿佐菌素,在45 min內(nèi)注射完畢。鏈尿佐菌素注射后10 h內(nèi)喂水采用10%葡萄糖,以防止低血糖。24 h～72 h分別每天監(jiān)測一次血糖,連續(xù)兩次血糖＞25mg/L視為糖尿病模型造模成功。以后根據(jù)血糖情況隔天腹部皮下注射中效胰島素諾和靈N 2 U～4 U,使血糖保持在250 mg左右。結(jié)果造模成功25只,飼養(yǎng)中于第3周、第5周共死亡2只,最后入組存活23只,其中雌鼠12只、雄鼠11只。隨機棄用雌鼠1只,以保持性別平衡。余20只大鼠同批給予腹腔注射由檸檬酸、檸檬酸鈉配成的pH值為4.2的緩沖液,72 h后測定血糖均在正常范圍。

1.2.2 分組 將SD大鼠隨機分為兩組,一組經(jīng)鏈尿佐菌素誘發(fā)的糖尿病模型組(DM組),另一組為血糖正常對照組(C組),兩組再隨機分為4組,即糖尿病(DM1)組:隨機抽取糖尿病模型鼠12只(雌雄各半),生理鹽水灌胃1次/天,共5周;糖尿病通心絡(luò)(DM2)組:剩余糖尿病模型鼠 10只(雌雄各半),通心絡(luò)膠囊(由石家莊以嶺藥業(yè)有限公司提供)灌胃1次/天,1粒/次,共5周;正常血糖組(C1組):隨機抽取未造模 SD大鼠10只(雌雄各半),生理鹽水灌胃 1次/天,共 5周;正常血糖通心絡(luò)組(C2組):剩余未造模SD大鼠10只(雌雄各半),通心絡(luò)膠囊灌胃同DM2組。實驗始分別測定四組SD大鼠的體重、血糖,4組SD大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。血糖測定用Surestep血糖儀測定,由強生有限公司生產(chǎn)。

1.2.3 腎重/體重值、腎皮質(zhì)PAI-1 mRNA表達 喂養(yǎng)第5周末所有大鼠測血糖、稱體重,烏拉坦腹腔注射麻醉后取所有大鼠右腎,立即秤重,計算腎重/體重值,而后取部分腎皮質(zhì),分裝于凍存管內(nèi)立即投入液氮內(nèi)保存。將大鼠腎皮質(zhì)利用Trizol液提取總RNA,用紫外分光光度儀分別測定其A 260/280值為1.8～2.0,符合 RNA樣本純度要求,同時測定樣本 RNA濃度。取4 g RNA加入隨機引物,以總RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR法同管擴增PAI-1及內(nèi)參照物GAPDH的cDNA。PCR反應(yīng)條件為:94℃變性50 s,57℃退火50 s,72℃延伸50 s,共29個循環(huán),結(jié)束前72℃延伸10 min。

PAI-1引物設(shè)計通過GeneBank查出PAI-1的基因序列,用Primers軟件設(shè)計引物。PAI-1上游引物:AGC GCC TGT TCC ACA AGT CT;下游引物:GCT CTC GT TCAC CTC GAT CT,擴增產(chǎn)物長度436bp。

RT-PCR試劑盒提供及PAI-1引物合成均來自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。GAPDH引物由本院外科實驗室饋贈。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的鑒定和半定量檢測 取各樣本PCR產(chǎn)物5 μ L,加樣于l.8%的瓊脂糖凝膠電泳50 min后以IS-1000多功能凝膠成像儀定量掃描條帶灰度,PAI-1條帶與相應(yīng)GAPDH條帶進行灰度對比,以PAI-1產(chǎn)物電泳條帶灰度/GAPDH產(chǎn)物電泳條帶灰度比值(PAI-1/GAPDH)來半定量分析PAI-1mRNA的表達量。

2 結(jié) 果

DM 組(DMl+DM2)大鼠血糖、腎重/體重值、腎皮質(zhì) PAI-1 mRNA表達量較對照組(C1+C2)顯著增高(P＜0.01)。DM 2組腎皮質(zhì)PAI-1mRNA表達量較DM l組明顯減少(P＜0.05);DM2組與Cl組比較 PAI-1mRNA表達明顯升高(P＜0.01),以上各參數(shù)在C2組與Cl組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1、表2。

表1 糖尿病組、對照組PAI-1mRNA表達量(±s)

表1 糖尿病組、對照組PAI-1mRNA表達量(±s)

組別 n 治療前血糖mg/L治療后血糖mg/L體重g腎重g腎重/體重g/kg PAI-1/GAPDH DM 組 22 32.34±5.27 27.33±3.38 215.70±23.25 1.13±0.15 5.26±0.66 0.77±0.09 C組 20 7.26±0.71 7.54±0.90 314.60±45.12 1.15±0.14 3.70±0.52 0.47±0.08 F值 20.8 16.3 18.2 0.473 1.99 0.248 P 0.01 0.01 0.01 0.619 0.01 0.01

表2 各組PAI-1mRNA表達量(±s)

表2 各組PAI-1mRNA表達量(±s)

組別 治療前血糖mg/L治療后血糖mg/L體重g腎重g腎重/體重g/kg PAI-1/GAPDH DM 組 33.16±5.95 26.93±3.30 26.93±3.30 1.16±0.16 5.39±0.57 0.90±0.071)DM2組 31.35±4.432) 27.81±3.582) 216.1±26.82) 1.09±0.12 5.11±0.762) 0.82±0.092)C1組 7.33±0.76 7.66±0.97 308.3±39.7 1.15±0.14 3.76±0.58 0.53±0.06 C2組 7.19±0.69 7.42±0.86 320.9±51.3 1.16±0.14 3.65±0.49 0.51±0.09 DM1組與DM2組比較,1)P＜0.05;DM 2組與C1組比較,2)P＜0.01

3 討 論

PAI-1屬于絲氨酸抑制劑家族的一員,它是一分子量52 kD的單鏈糖蛋白,PAT-1活性中心的氨基酸Arg346-Met347可與組織型纖溶酶原激活物(t-PA)或尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)活性中心的絲氨酸發(fā)生不可逆的共價結(jié)合,

形成1∶1復(fù)合物,導(dǎo)致t-PA或u-PA的失活。因此它是t-PA、u-PA的專一性、快速性有效生理抑制劑,在體內(nèi)纖溶與抗纖溶系統(tǒng)的平衡調(diào)節(jié)中起重要作用,也因此與許多血栓性疾病包括糖尿病慢性大血管、微血管并發(fā)癥密切相關(guān)。PAI-1主要存在于血漿,在腎臟包括腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞、系膜細胞和內(nèi)皮細胞都有表達合成[3]。研究發(fā)現(xiàn)PAI-1能有效地抑制纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,而后者負責(zé)降解腎小球細胞外基質(zhì),PAI-1在腎組織內(nèi)水平或活性的升高促使纖維蛋白水解和腎小球細胞外基質(zhì)(extracullar mattix,ECM)降解作用的下調(diào),從而腎組織纖維蛋白沉積,ECM積聚,并導(dǎo)致或促進腎小球發(fā)生纖維化及硬化[4]。而糖尿病腎病的病理改變則主要為腎臟肥大,基底膜增厚和腎小球、腎小管ECM的進行性積聚,故PAI-1作為纖溶系統(tǒng)和ECM更新調(diào)控系統(tǒng)的一個關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)劑,它在腎組織的表達增高在腎小球疾病尤其DN的發(fā)生發(fā)展中占有重要位置。

本實驗通過比較糖尿病模型組大鼠和正常對照組大鼠的腎臟肥大指數(shù)(腎重/體重)及對其腎組織PAI-1mRNA表達量進行半定量比較分析,發(fā)現(xiàn)DM組的腎組織PAI-1mRNA表達量比正常血糖組明顯增高,DM組大鼠的腎臟肥大指數(shù)明顯高于正常血糖組腎臟肥大指數(shù)且與腎組織PAI-1mRNA表達量增高一致。由于PAI-1蛋白水平的調(diào)節(jié)主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),故推測PAI-1蛋白在糖尿病時腎組織的合成分泌增多與腎臟肥大,DN密切相關(guān)。DM時PAI-1mRNA的升高可能與高糖、高三酰甘油血癥、低密度脂蛋白(LDL)升高密切相關(guān),DM時高糖本身或非酶糖化的LDL等可通過激活PAI-1啟動子(promoter)而導(dǎo)致內(nèi)皮細胞等表達PAI-1mRNA增強[5-7]。而且已明確DM時腎組織合成及分泌TGF-β明顯增高,而TGF-β1可激活一種蛋白,后者可作為PAI-1基因表達調(diào)控區(qū)的反式作用因子與之結(jié)合誘導(dǎo)PAI-1的表達增加[1]。本實驗未進行腎臟病理學(xué)對照研究,擬在進一步實驗時,進行血生化及腎臟病理學(xué)研究。

本實驗的另一目的是研究中藥通心絡(luò)膠囊對PAI-1的干預(yù)作用,發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)膠囊灌服的糖尿病大鼠,即DM+通心絡(luò)組(DM2)的腎組織PAI-1mRNA表達較糖尿病但不用通心絡(luò)組(DM l)的減少,但兩組間腎臟肥大指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能由于PAI-1mRNA的變化早于腎臟形態(tài)和病理學(xué)變化,而本實驗研究時間較短有關(guān)。正常對照中通心絡(luò)灌服組與生理鹽水灌服組之間腎皮質(zhì)PAI-1mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)意義,說明通心絡(luò)對健康大鼠的PAI-1表達沒有影響。但DM+通心絡(luò)組的腎臟肥大指數(shù)和腎組織PAI-1mRNA表達量高于正常血糖組的表達量,有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明通心絡(luò)對DM時過度亢進的纖溶抑制及糖尿病時的腎臟肥大有明顯的下調(diào)作用,但還未能使之達到正常表達水平,可能與高血糖、高 LDL、TGF-β等因素未能控制有關(guān)。

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