抗顫寧方對(duì)PD大鼠脂質(zhì)過氧化及多巴胺能神經(jīng)元的影響1)

張希廉,田軍彪

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD雌性大鼠(許可證號(hào):SCXK冀2003-1-003)60只,體重(200±20)g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 SR-6N型大鼠腦立體定位儀(日本),BP211D型微量天平(中國(guó)),LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(中國(guó)),5 μ L微量進(jìn)樣器(上海),OLYMPUS CH2O型顯微鏡(德國(guó)),Leica RM2245型石蠟切片機(jī)(德國(guó)),圖像分析系統(tǒng)(美國(guó))。

1.3 主要藥物和試劑 美多巴:瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏有限公司;6-OHDA、阿撲嗎啡(APO):Sigma公司;中藥抗顫寧8劑:河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院制劑室制備;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NO測(cè)試盒:南京建成生物工程研究所;一抗T H抗體(1∶100):美國(guó)SANTA CRUZ 公司;二抗IgG(1∶200):河北博海生物工程有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 中藥煎取 龜板15 g,白芍20 g,黃芪15 g,當(dāng)歸12 g,雞血藤15 g,天麻15 g,川樸15 g,云苓 12 g,川芎 6 g,炙甘草9 g,水煎2次,將兩煎液混合濃縮成每 1 mL含生藥3.35 g的水煎液,分裝,密封,冷藏保存。

1.4.2 動(dòng)物分組 全部大鼠均進(jìn)行行為檢測(cè),確認(rèn)無震顫、運(yùn)動(dòng)減少、肢體僵硬、豎毛、豎尾等行為后,每籠5只喂養(yǎng)(室溫 22℃,濕度45%)。1周后隨機(jī)選出8只作為假手術(shù)組;其余造模,造模成功大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成模型組、中藥組、西藥組各8只。

1.4.3 模型制備 取SD大鼠,用10%水合氯醛給予大鼠腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,剪去頭部頭發(fā),在常規(guī)消毒下,于頭顱正中切開頭皮和皮下組織,確定前囟坐標(biāo),參照文獻(xiàn)[1]大鼠腦立體定位圖譜,確定右側(cè)黑質(zhì)兩坐標(biāo)為:①前囟尾側(cè)4.4 mm,矢狀縫右側(cè)1.2 mm,硬膜下7.8 mm;②前囟尾側(cè)4.8 mm,矢狀縫右側(cè)1.0 mm,硬膜下7.8 mm。計(jì)算出注射點(diǎn)的相對(duì)坐標(biāo),進(jìn)行標(biāo)記定位后,牙科鉆在相應(yīng)部位鉆透顱骨,勿損傷硬腦膜。用5 μ L微量進(jìn)樣器吸取6-OHDA 4μL(濃度為4 μ g/μL),每孔 2 μ L,緩 慢進(jìn)針至預(yù)定深度,以 1 μ L/min 的速度注入,注射完畢后留針10 min,以1 mm/min的速度緩慢退出,縫合皮膚。術(shù)后前3 d腹腔注射青霉素鈉2×105U,以預(yù)防感染。

1.4.4 行為學(xué)檢測(cè) 術(shù)后第14天進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),給受試大鼠腹腔注射APO 0.5 mg/kg,以誘發(fā)大鼠向左側(cè)單向旋轉(zhuǎn),并記錄旋轉(zhuǎn)開始時(shí)間、結(jié)束時(shí)間和旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。若大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)(圈數(shù)不限),視為模型制作成功大鼠。

1.4.5 給藥方法 中藥組大鼠灌服抗顫寧方,西藥組大鼠灌服美多巴,用藥量分別為:33.5 g/kg、125 mg/kg,分別相當(dāng)于按人和動(dòng)物每千克體重劑量的15倍、30倍[2];模型組大鼠給予等體積的蒸餾水。于術(shù)后第15天給藥,每日劑量于16:00～17:00 1次灌胃,均灌胃 14 d。

1.4.6 測(cè)定抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化改變 末次灌胃后次日將大鼠用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉后打開腹腔,充分暴露心臟,用5 mL注射器針頭刺進(jìn)左心室,取不抗凝全血3 mL,靜置20min后用低速離心機(jī)3000r/min離心15min后取血清,-37℃冰箱保存,以比色法分別測(cè)定血清中SOD的活性、MDA含量及NO含量。

1.4.7 酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學(xué)染色 取血后依次經(jīng)左心室從升主動(dòng)脈灌注約200 mL生理鹽水,同時(shí)剪開右心耳,隨后再灌注4%多聚甲醛作內(nèi)固定,而后斷頭取腦浸泡于4%多聚甲醛溶液中放4℃冰箱固定24 h,然后用PBS漂洗30 min,每分鐘3次,梯度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋。作石蠟連續(xù)冠狀切片,片厚 5μ m,切片直接貼覆于明膠包被的載玻片上,每塊組織間隔選取4張切片,將切片脫蠟,用0.01 mol/L PBS沖洗后,用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的4%多聚甲醛室溫固定30 min,然后按SABC法作TH免疫組織化學(xué)染色,200倍相差顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)4 mm2的視野,用圖像分析系統(tǒng)分別累計(jì)右側(cè)黑質(zhì)的TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目并計(jì)算其均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或完全隨機(jī)的單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療后SOD、MDA和NO變化(見表1) 模型組與西藥組大鼠SOD活性均較假手術(shù)組明顯下降(P＜0.01),中藥組大鼠SOD活性與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);模型組大鼠 MDA、NO含量與假手術(shù)組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(P＜0.05),而中藥組與西藥組大鼠MDA、NO含量與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠給藥后SOD、M DA和NO變化(±s)

表1 各組大鼠給藥后SOD、M DA和NO變化(±s)

組別 SOD(U/mL) M DA(μ mol/L) NO(μ mol/L)假手術(shù)組 148.592±17.000 22.725±7.005 25.778±14.389模型組 108.298±16.0302) 33.151±7.7091) 79.776±22.0761)西藥組 118.612±15.4322) 22.377±3.1903) 49.778±25.2343)中藥組 144.620±6.4014) 22.275±2.3413) 32.446±15.0603)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05;與西藥組比較,4)P＜0.05

2.2 各組大鼠右側(cè)黑質(zhì)的T H陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(見表2) 假手術(shù)組、中藥組、西藥組大鼠右側(cè)黑質(zhì)的TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均多于模型組(P＜0.01);中藥組大鼠右側(cè)黑質(zhì)的T H陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)亦多于西藥組(P＜0.05);假手術(shù)組大鼠右側(cè)黑質(zhì)的TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)多于西藥組(P＜0.01);中藥組大鼠右側(cè)黑質(zhì)的TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與假手術(shù)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠右側(cè)黑質(zhì)T H陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)

表2 各組大鼠右側(cè)黑質(zhì)T H陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)

組別 視野 右側(cè)黑質(zhì)假手術(shù)組 20 42.000±15.3791)模型組 20 5.160±6.598中藥組 20 33.200±11.3891)西藥組 20 17.600±4.3931)3)與模型組比較,1)P＜0.01;中藥組與西藥組比較,2)P＜0.05;西藥組與假手術(shù)組比較,3)P＜0.01

2.3 各組右側(cè)黑質(zhì)的TH陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果 在假手術(shù)組右側(cè)黑質(zhì)可見密集的TH陽(yáng)性細(xì)胞,呈棕褐色,這些細(xì)胞體主要為圓形或卵圓形,少數(shù)為多邊形,有些細(xì)胞分枝狀樹突、單根或成束的軸突清晰可見[3]。而模型組右側(cè)黑質(zhì)可見少量、稀疏的TH陽(yáng)性細(xì)胞,呈棕褐色,細(xì)胞計(jì)數(shù)為假手術(shù)組右側(cè)黑質(zhì)的12.29%(5.16/42);而中藥組黑質(zhì)可見較密集的TH陽(yáng)性細(xì)胞,呈棕褐色,細(xì)胞體亦主要為圓形或卵圓形,少數(shù)為多邊形,細(xì)胞計(jì)數(shù)為假手術(shù)組右側(cè)黑質(zhì)的79.05%(33.2/42);西藥組亦可見密集的T H陽(yáng)性細(xì)胞,呈棕褐色,細(xì)胞體亦主要為圓形或卵圓形,少數(shù)為多邊形,細(xì)胞計(jì)數(shù)為假手術(shù)組右側(cè)黑質(zhì)的41.91%(17.6/42)。

3 討 論

3.1 脂質(zhì)過氧化 現(xiàn)代研究認(rèn)為,6-OHDA通過和多巴胺競(jìng)爭(zhēng),可與高親和力的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合進(jìn)入黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元,并迅速被分子氧氧化形成 H2O2、超氧化物和醌,生成的大量活性氧自由基和氫氧自由基[4]超出了多巴胺能神經(jīng)元自身抗氧化清除自由基的能力,使生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),產(chǎn)生一系列的脂質(zhì)過氧化物,其中MDA毒性最強(qiáng),發(fā)揮神經(jīng)毒性作用,導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元死亡。另外,6-OHDA還有抑制線粒體呼吸鏈的功能,誘發(fā)細(xì)胞凋亡等方面機(jī)制而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:抗顫寧方在增加SOD的活性方面優(yōu)于美多巴,而在減低MDA含量方面與美多巴無差別;SOD活性的降低使得自由基的產(chǎn)生過多,自由基的增加使得不飽和脂肪酸水平降低,其代謝產(chǎn)物MDA在體內(nèi)增加,這是基于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)的結(jié)果。有研究表明[5]:在PD的早期,黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元中的SOD活性增強(qiáng),這是自由基產(chǎn)生增多時(shí)機(jī)體的一種代償性反應(yīng);隨著病情的加重,氧化和抗氧化的平衡關(guān)系被打破,導(dǎo)致細(xì)胞的受損和死亡。

3.2 NO的神經(jīng)毒性作用 NO是一種具有自由基性質(zhì)的生物活性分子,在體內(nèi)有生物信使作用,但過量的NO還表現(xiàn)出神經(jīng)毒性[6]。NO和過氧化物反應(yīng)產(chǎn)生的過亞硝酸鹽能降低黑質(zhì)紋狀體通路中細(xì)胞的抗氧化能力,導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡;另外,NO還會(huì)引起許多蛋白的亞硝基化,抑制磷酸化和糖酵解通路;也可通過損害DNA導(dǎo)致二磷酸腺苷核糖多聚酶過度活化引起神經(jīng)細(xì)胞三磷酸腺苷衰竭和死亡發(fā)揮神經(jīng)毒性作用[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗顫寧方可降低血清中NO的含量。

3.3 T H免疫組織化學(xué) 由于黑質(zhì)致密部呈斜扁柱狀,體積狹小,在冠狀面上最長(zhǎng)垂直距離不足0.5 mm。TH作為DA能神經(jīng)元的標(biāo)志物具有特異性[8],故TH免疫組織化學(xué)方法常被用于顯示DA能神經(jīng)元細(xì)胞體及其突起。本研究應(yīng)用TH免疫組織化學(xué)方法清晰地顯示了神經(jīng)元細(xì)胞體及突起。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中藥和西藥均能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受損害,但中藥療效優(yōu)于西藥。

3.4 帕金森病的中西醫(yī)治療概況 帕金森病(PD)是臨床上較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一,具有特征性的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)特點(diǎn)。目前對(duì)于帕金森病的治療常采用多巴胺類制劑,但這些藥物不能阻止病情的進(jìn)展,且隨著病情發(fā)展,用藥量會(huì)逐漸增大,許多病人會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥及副反應(yīng),而且病情晚期會(huì)出現(xiàn)種種非多巴胺能的非運(yùn)動(dòng)障礙癥狀,現(xiàn)有的多巴胺能或非多巴胺能藥物幾乎對(duì)這些癥狀無效。手術(shù)治療亦有其局限性,細(xì)胞移植及基因治療有望治愈帕金森病,但仍處于試驗(yàn)研究階段[9]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療帕金森病具有獨(dú)特的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn),中醫(yī)藥從整體辯證著眼,標(biāo)本兼治,通過調(diào)節(jié)機(jī)體整體狀況,提高生存質(zhì)量而起作用;與西醫(yī)藥相比,中醫(yī)藥具有適應(yīng)性廣、不良反應(yīng)小、遠(yuǎn)期療效較好且不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點(diǎn);另外,很多研究者對(duì)服用美多巴產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)波動(dòng)癥進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),中藥可減少劑末少動(dòng)及開關(guān)現(xiàn)象的發(fā)生,并可延長(zhǎng)開期時(shí)間[10]。但是諸家對(duì)帕金森病的辨證和治療存在分歧,說明中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合對(duì)帕金森病的認(rèn)識(shí)尚處于較淺的層面;另外,目前國(guó)際上已有大量文獻(xiàn)探討帕金森病的非運(yùn)動(dòng)障礙癥狀的問題;中醫(yī)文獻(xiàn)中還很少有關(guān)中藥治療帕金森病非運(yùn)動(dòng)癥狀的報(bào)道。帕金森病病因繁多,病機(jī)復(fù)雜。古代醫(yī)家對(duì)此病多從肝、從腎、從風(fēng)方面治療?，F(xiàn)代醫(yī)家對(duì)本病的治療用藥也進(jìn)行了大量的研究[11,12]。

通過長(zhǎng)期臨床觀察認(rèn)為帕金森病主要病變部位在腦,主要病機(jī)是由于肝腎陰虛,虛風(fēng)內(nèi)動(dòng),損傷腦絡(luò),神機(jī)受損,筋脈肢體失控,加之久病入絡(luò),耗氣傷血,致氣血虧虛,筋脈失養(yǎng),而發(fā)肢體震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩。創(chuàng)制了滋補(bǔ)肝腎、益氣養(yǎng)血、熄風(fēng)止顫中藥抗顫寧方;方中龜板、天麻為君藥,黃芪、當(dāng)歸為臣藥,白芍、雞血藤、川芎、川樸、云苓為佐藥,炙甘草為佐使藥。帕金森病早期可單獨(dú)應(yīng)用中醫(yī)藥,推遲多巴胺類制劑的使用時(shí)間;帕金森中晚期使用多巴胺類制劑且同時(shí)應(yīng)用中醫(yī)藥,可減少多巴胺類制劑的用量,減輕西藥的不良反應(yīng),從而延長(zhǎng)多巴胺類制劑的使用時(shí)間,并可在一定程度上解決西藥的不良反應(yīng)及對(duì)藥物的耐受性而不能堅(jiān)持服藥的問題。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]表明抗顫寧方治療帕金森病的可能機(jī)制在于:一是改善整體和局部腦組織的氧化應(yīng)激狀態(tài),減少自由基對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的氧化損害;二是可能通過抑制NO的神經(jīng)毒性起作用;三是可能通過保護(hù)DA能神經(jīng)元免受損害而相對(duì)增加其數(shù)量起作用。

[1] 包新民,舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1988:16-31.

[2] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:31.

[3] Soslow RA,Dannenberg AJ,Rush D,et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary,colonic,and mammary tumors[J].Cancer,2000,89:2637-2645.

[4] Shinohara R,Mano T.Nagasaka A,et al.Lipid peroxidation leverls in tat cardiac muscle are affected by age and thyroid status[J].Endocrinol,2000,164(1):97-192.

[5] 王紅梅,羅德欣,王志平,等.帕金森病與自由基的生成和氧化的關(guān)系[J].中國(guó)臨床康復(fù),2002,6(3):373.

[6] Ebadi M,Sharma SK.Peroxy nit rite and mitochondrial dysfunction in the pat hogenesis of Parkinson's disease[J].Antioxid Redox Signal,2003,5(3):319-335.

[7] Jenner P.Oxidative stress in Parkinson's disease[J].Ann neurol,2003,53(suppl 3):26-36.

[8] 王堯,杜子威.神經(jīng)生物化學(xué)與分子生物學(xué)[M].北京:北京人民衛(wèi)生出版社,1997:142-143.

[9] Pardridge WM.T yrosine hydroxylase replacement in experimental Parkinson's disease with transvascular gene therapy[J].Neuro Rx,2005,2(1):129-138.

[10] 沈偉,袁燦興.滋補(bǔ)肝腎中藥治療帕金森病運(yùn)動(dòng)功能波動(dòng)的臨床觀察[J].黑龍江中醫(yī)藥,2006(3):7-9.

[11] 鮑曉東.試論中醫(yī)藥治療帕金森病的綜合優(yōu)勢(shì)[J].中醫(yī)雜志,2006,47(8):619-620.

[12] 何建成.帕金森病中醫(yī)藥治療的再思考-兼談“滋腎平肝,化痰活血,解毒散結(jié)”是帕金森病的基本治療法則[J].中醫(yī)藥通報(bào),2005,4(1):12-14.

[13] 張希廉,田軍彪.抗顫寧方對(duì)帕金森病大鼠行為學(xué)及脂質(zhì)過氧化的影響[J].河北中醫(yī)雜志,2009,31(3):441-443.