一種新型結(jié)締組織生長(zhǎng)因子人源單鏈抗體的可溶性表達(dá)以及分離純化

范小波，茍麗霞，劉昭，沈子龍，劉乃豐，吳國(guó)球，奚濤

(1.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，江蘇南京 210009)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)含有344個(gè)氨基酸，由生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)、整合素蛋白識(shí)別功能域、肝素和黏蛋白結(jié)合域以及二聚體作用位點(diǎn)4個(gè)分泌蛋白模塊組成［1］。在纖維化疾病中，組織生長(zhǎng)因子(TGF)作為一個(gè)重要的細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的形成，研究認(rèn)為胞外基質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)紊亂和肺纖維化、腎纖維化、肌營(yíng)養(yǎng)不良以及其他的許多纖維化相關(guān)疾病的發(fā)病密切相關(guān)［1－2］。然而，TGF 是一個(gè)具有廣泛生理功能的細(xì)胞因子，大量研究顯示直接抑制TGF的生物學(xué)功能會(huì)抑制正常生理機(jī)能，從而對(duì)機(jī)體造成損害［3］。CTGF作為在纖維化疾病中TGF的一個(gè)主要下游分子，有望成為治療纖維化疾病的一個(gè)非常理想的靶點(diǎn)。

單鏈抗體scFv由免疫球蛋白的可變區(qū)組成，分子量只有正?？贵w的1/5［4］，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床治療和檢驗(yàn)。目前，片段抗體的生產(chǎn)大多采用原核表達(dá)，但是由于scFv抗體含有兩對(duì)二硫鍵，而原核細(xì)胞缺少翻譯后修飾，給scFv抗體的生產(chǎn)帶來(lái)了一定的技術(shù)難題。有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)加入融合伴侶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferas，GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MPB)可以幫助蛋白在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，增加可溶性，而且還具有較高的生物學(xué)活性［5－6］。

1 菌株、載體和試劑

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌BLR(DE3)菌株和BL21(DE3)菌株購(gòu)自 New England Biolabs公司(Beverly，MA，USA)，pET28a、pET32a購(gòu)自 novagen公司(Madison，Wisconsin，USA)，pET-EI:X質(zhì)粒由普林斯頓大學(xué) David W Wood教授惠贈(zèng)。

1.2 試劑

內(nèi)切酶NcoⅠ和NotⅠ購(gòu)自 New England Biolabs公司;Anti-CTGF scFv基因由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供［7］;LB培養(yǎng)基含0.2%葡萄糖、1.5%酵母提取物、2%酪蛋白、2%(NH4)2SO4、0.1%MgSO4、0.3%K2HPO4、1%NaCl，用作BL21的培養(yǎng)液;TB培養(yǎng)基(每升含12 g酪蛋白、24 g酵母提取物、2.31 g KH2PO4和 12.54 g K2HPO4)用于 BLR菌株的培養(yǎng)液;溶菌緩沖液(1 mmol·L－1Tris-HCl、pH 8.5，2 mmol·L－1EDTA，0.1 mg·ml－1lysoozyme)和裂解緩沖液(PBS 緩沖液加上 40 mmol·L－1Bis-Tris、pH 6.2，2 mmol·L－1EDTA)用于pET-EI:X-EI:scFv表達(dá)的純化;羊抗鼠HRP-IgG抗體、鼠抗CTGF/CCN2抗體和小牛血清購(gòu)自R＆D公司(USA);CTGF/CCN2標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Peprotech公司(英國(guó)，倫敦);鎳親和柱和Sephadex gel G-50購(gòu)自Novagen公司(Madison，Wisconsin，USA)。本研究中所使用的其他試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 Scfv抗體表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 pET32a-TrxA-scFv-His、pET28a-scFv-His載體的構(gòu)建 由噬菌體展示技術(shù)獲得的scFv基因片段含有NcoⅠ和NotⅠ位點(diǎn)。用NcoⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶分別酶切scFv基因和pET32a、pET28a質(zhì)粒，用連接酶過(guò)夜連接獲得pET32a-TrxA-scFv-His、pET28a-scFv-His表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21。所構(gòu)建的兩個(gè)載體都具有ampicillin抗性。

2.1.2 pET-EI:scFv載體的構(gòu)建 scFv基因先經(jīng)PCR擴(kuò)增(引物:5'AAAGTTGTACACAACATGGCCGAG GTGCAGCTGGTGGAGT;3'TGATGGTGATGATGATGT GCGGCCGCACCTA)，在scFv基因5'端添加一個(gè)BsrGⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)。擴(kuò)增后的scFv基因和pET-Ei:X質(zhì)粒分別用BsrGⅠ和NotⅠ過(guò)夜酶切，然后用連接酶過(guò)夜處理，獲得pET-EI:scFv表達(dá)載體。pET-EI:scFv表達(dá)載體帶有ampicillin和kanamycin抗性。

2.2 scFv在不同載體和菌株中的表達(dá)

用pET-EI:scFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BLR，經(jīng)涂板篩選出具有 ampicillin 抗性的菌株，在37 ℃、170 r·min－1條件下用含有200 μg·ml－1ampicillin的TB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，然后在18℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。用pET32a-TrxA-scFv-His和pET28a-scFv-His分別轉(zhuǎn)化BL21菌株，經(jīng)涂板ampcillin篩選后，挑選具有ampicllin抗性的克隆分別用BL21培養(yǎng)基在37℃、170 r·min－1條件下培養(yǎng)過(guò)夜，用 1.0 mmol·L－1IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。各組的裂解產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)情況。

2.3 scFv在pET-EI:scFv/BLR中的純化

融合蛋白和scFv的純化步驟參照標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)［8］。通過(guò)搖瓶表達(dá) pET-EI:scFv/BLR，5 000 r·min－1、4℃條件下離心10 min回收細(xì)胞?；厥盏募?xì)胞按每克細(xì)胞使用5 ml溶菌液重懸，經(jīng)超聲破碎后于4℃離心回收上清。取10 ml上清轉(zhuǎn)移到50 ml的離心管中，加入10 ml 3 mol·L－1NaCl;37 ℃孵化10 min，室溫下12 000 r·min－1離心10 min回收沉淀。將沉淀重懸到1 ml預(yù)冷的裂解液中，室溫下裂解過(guò)夜，然后加入1 ml 3 mol·L－1NaCl溶液，室溫下孵育 10 min 后5 000 r·min－1離心回收上清。

2.4 scFv在 pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中可溶性表達(dá)的溫度優(yōu)化

根據(jù)pET使用手冊(cè)，本研究對(duì)影響蛋白可溶性表達(dá)的主要因素溫度進(jìn)行優(yōu)化。菌體在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)后，分別在37 ℃和18 ℃條件下用1.0 mmol·L－1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h。離心回收細(xì)胞，分別取1 g細(xì)胞用溶菌緩沖液裂解，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的目的蛋白。

2.5 pET32a-TrxA-scFv-His中 scFv的純化

挑選1個(gè)含有 pET32a-TrxA-scFv-His質(zhì)粒的BL21單克隆在5 ml含0.1%ampicillin的LB培養(yǎng)液中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到500 ml含0.01%ampicillin的LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí)迅速冷卻至18 ℃，并添加1.0 mmol·L－1的 IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)5 h。發(fā)酵液在室溫條件下，5 000 r·min－1離心10 min回收細(xì)胞?；厥盏募?xì)胞按每克細(xì)胞使用5 ml溶菌液重懸;重懸液室溫下放置過(guò)夜后超聲破碎;4℃下8 000 r·min－1離心20 min回收上清液。上清液用鎳親和層析回收融合蛋白，回收的融合蛋白于純水中過(guò)夜透析后凍干處理，凍干樣品按mg蛋白·ml－1酶切裂解液溶解，經(jīng)凝血酶酶切后用G50層析柱除去雜質(zhì)，回收scFv蛋白。

2.6 scFv的生物活性測(cè)定

將獲得的scFv抗體用2×稀釋的方法從1.6 μg·ml－1到 0.1 μg·ml－1的濃度以 50 μl·孔－1包被到 96 孔板上。4℃過(guò)夜后，用含1%tween的PBS洗滌后加入50 μl·孔－1的1.0 μg·ml－1的 CTGF 標(biāo)準(zhǔn)品，于37 ℃ 溫箱中孵育 2 h 后洗滌并加入 50 μl·孔－1的 1.0 μg·ml－1的鼠抗CTGF/CCN2抗體，并在37℃下孵育1 h，再經(jīng)洗滌后加入 50 μl·孔－1的 1 μg·ml－1羊抗鼠 HRPIgG抗體。最后加入顯色劑，待顯色完全后加入終止液并用ELISA酶標(biāo)儀記錄結(jié)果［9］。

3 結(jié) 果

3.1 pET28a-scFv-His、pET32a-TrxA-scFv-His、pET-EI:scFv質(zhì)粒的構(gòu)建

3個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建完畢之后送往上海生工(上海)測(cè)序，結(jié)果顯示3個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建成功。如表1所示，pET28a-scFv-His中，scFv只在N端添加了1個(gè)Met密碼子，末尾連接6個(gè)HIS密碼子并緊接1個(gè)終止密碼子;pET32a-TrxA-scFv-His中，scFv被融合到TRxA蛋白的C端，scFv N端附加6個(gè)His;pET-EI:scFv中，scFv被克隆到Intein C端。

表1 抗體蛋白scFv在3種載體中的構(gòu)建、表達(dá)和純化Tab 1 The construction，expression and purification of scFv in three vectors

3.2 scFv在3個(gè)質(zhì)粒和菌株中的表達(dá)

如表1所示，scFv蛋白在pET28a-scFv-His/BL21中，誘導(dǎo)前后沒(méi)有觀察到目的蛋白明顯表達(dá)，Western結(jié)果顯示scFv蛋白不表達(dá)(data not shown);在pETEI:scFv/BLR和pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中均成功表達(dá)(見(jiàn)圖1、2)，其中融合蛋白TrxA-scFv-His相對(duì)分子質(zhì)量約為43 000，Elastin-intein-scFv融合蛋白約為90 000。

圖1 scFv抗體蛋白在pET-EI:scFv/BLR中的表達(dá)和純化Fig 1 The expression and purification of scFv in pET-EI:scFv

3.3 scFv在pET-EI:scFv/BLR中的表達(dá)純化

通過(guò)反復(fù)的加入高鹽鹽析和重新溶解，融合蛋白不斷得到純化，但是電泳結(jié)果顯示，scFv無(wú)法從融合蛋白Elastin-intein-scFv中裂解游離出來(lái)(圖1)。

3.4 溫度對(duì)scFv蛋白在 pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中表達(dá)的影響

pET32a-TrxA-scFv-His/BL21在37℃條件下表達(dá)的產(chǎn)物主要為包涵體或者其他不能與鎳柱結(jié)合的形式，而18℃條件下scFv的表達(dá)主要為可溶性表達(dá)，可以吸附到鎳親和柱上，并能被高濃度咪唑溶液洗脫下來(lái)(圖3)。

圖2 scFv蛋白在pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中的表達(dá)和純化Fig 2 The expression and purification of scFv in pET32a-TrxA-scFv-Hi/BL21

圖3 溫度對(duì)scFv蛋白在pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中表達(dá)的影響Fig 3 Effect of temperature on the expression of fusion of scFv in pET32a-TrxA-scFv-His/BL21

3.5 scFv蛋白在 pET32a-TrxA-scFv-His/BL21中的表達(dá)和純化

優(yōu)化后，在18℃條件下表達(dá)的scFv主要以可溶性的形式存在，融合蛋白占總蛋白的30%左右，經(jīng)鎳柱初步純化后回收的融合蛋白的純度能達(dá)到50%左右。酶切后經(jīng)進(jìn)一步的分子篩分離純化，電泳純度能達(dá)到85%以上(圖2)。

3.6 scFv生物學(xué)活性測(cè)定

如圖4 所示，在包被0、5、10、20、40、80 ng scFv 抗體所測(cè)得 OD450nm分別為 0.022 15 ±0.000 85、0.080 35 ±0.002 45、0.162 50 ± 0.005 50、0.321 40 ± 0.015 30、0.631 35 ±0.002 95、1.295 20 ±0.048 80，組內(nèi)變異系數(shù)小于10%。經(jīng)回歸統(tǒng)計(jì)，OD450nm吸收值和抗體含量成線性關(guān)系(y=0.016 016x+0.005 071)，R=99.94%，P ＜0.05，說(shuō)明純化所得抗體 scFv與 CTGF是能特異性結(jié)合的，具有良好的生物活性。

圖4 純化后scFv抗體與CTGF特異性結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Fig 4 The special affinity of scFv towards CTGF by ELISA

4 討 論

本研究中scFv的基因來(lái)源于Griffin.1 library，之前的研究顯示這種來(lái)源的基因都很難獲得可溶性表達(dá)的產(chǎn)物。我們通過(guò)構(gòu)建pET32a-TrxA-scFv-His質(zhì)粒在低溫表達(dá)的條件下成功獲得溶解性的且具有免疫活性的產(chǎn)物，不同于以往的任何一種已經(jīng)報(bào)道的方法［4］。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)被大規(guī)模運(yùn)用于重組蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)，具有操作簡(jiǎn)單、周期短、耗費(fèi)低的特點(diǎn)，而且大部分表達(dá)的外源蛋白都能保持生物活性。但是，原核系統(tǒng)缺乏真核表達(dá)系統(tǒng)所具有的翻譯后修飾功能，很多復(fù)雜的具有二硫鍵的外源蛋白會(huì)以不具有生物學(xué)活性的包涵體形式存在。雖然目前的蛋白復(fù)性技術(shù)也在不斷發(fā)展，但是應(yīng)用的范圍往往受二硫鍵的多寡和蛋白空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度的限制，只能應(yīng)用于一些小的、簡(jiǎn)單的、二硫鍵少的蛋白的復(fù)性。相對(duì)于包涵體表達(dá)，可溶性表達(dá)具有很多優(yōu)點(diǎn)，之前很多的研究顯示大量的可溶性表達(dá)的蛋白可以不經(jīng)過(guò)復(fù)性就具有生物活性。有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)加入融合伴侶GST、NusA、MPB可以幫助蛋白在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，增加可溶性，而且還具有生物活性［5，10－11］。活性蛋白的生成依賴于正確空間結(jié)構(gòu)的形成，二硫鍵的正確形成是含二硫鍵的蛋白能否正確折疊的首要影響因素［12］。大部分分子伴侶無(wú)法使scFv在胞內(nèi)形成二硫鍵，需要在周質(zhì)空間里進(jìn)一步的氧化修飾或者體外復(fù)性處理。Trx是一種細(xì)菌來(lái)源的特殊的分子伴侶，它不但能夠促進(jìn)目的蛋白的折疊，而且能幫助蛋白在細(xì)菌體內(nèi)高效表達(dá)、提高穩(wěn)定性，并形成正確的二硫鍵［13］。

溫度是影響細(xì)菌可溶性表達(dá)的一個(gè)非常重要的因素，在不同的溫度下外源蛋白的表達(dá)形式也是不一樣的。有研究報(bào)道同一種蛋白在37℃下基本表達(dá)成包涵體的形式，但是在30℃下卻主要表達(dá)成溶解性的形式，且具有生物活性［14］。低溫能通過(guò)降低蛋白合成相關(guān)酶的活性減緩蛋白的表達(dá)速率，使蛋白有足夠的時(shí)間折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)［15］。在pET32a-scFv-His/BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)中，溫度是影響蛋白表達(dá)形式的主要因素，Trx-scFv-His融合蛋白在37℃下主要以包涵體的形式表達(dá)，而在18℃下主要表達(dá)成可溶性蛋白。

目的蛋白scFv無(wú)法以游離的形式在pET28ascFv-His/BL21(DE3)中表達(dá)，可能是mRNA不穩(wěn)定無(wú)法正常轉(zhuǎn)錄，也可能是蛋白的翻譯過(guò)程中出現(xiàn)了某些差錯(cuò)。在過(guò)去的研究中，外源蛋白的不表達(dá)一直是一個(gè)復(fù)雜的至今沒(méi)有定論的問(wèn)題。經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶的加入不僅可以幫助外源蛋白成功表達(dá)，而且還能大大提高表達(dá)產(chǎn)率和穩(wěn)定性。

Intein-system是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型表達(dá)系統(tǒng)，融合蛋白CBD-intein不但具有純化標(biāo)簽而且具有自我切割功能［16］。pET-EI:X是最近在Nature上才報(bào)道的一種，在Intein-system基礎(chǔ)上改進(jìn)的集表達(dá)純化于一體的新型表達(dá)系統(tǒng)。目的蛋白在pET-EI:scFv/BLR(DE3)中也成功得到表達(dá)。ELP的功能類(lèi)似于Trx能幫助scFv的表達(dá)，而且由于ELP具有獨(dú)特的自我聚集和溶解特性，可以不借助任何傳統(tǒng)的純化方法，只需要通過(guò)反復(fù)加入高濃度的NaCl就可以達(dá)到滿意的純化效果。pET-EI:X的另一個(gè)特性就是具有intein，它能通過(guò)特定的條件誘導(dǎo)自我裂解將scFv從融合蛋白中釋放出來(lái)。然而和現(xiàn)有的其他的具有intein的表達(dá)系統(tǒng)一樣，intein的自我裂解并非嚴(yán)格意義上可控，和與intein相連的幾個(gè)起始氨基酸有著重要關(guān)系，甚至外源蛋白的空間結(jié)構(gòu)也能大大影響裂解的效率［17］。scFv蛋白在 pET-EI:scFv/BLR(DE3)中成功得到表達(dá)，但是最終無(wú)法從融合蛋白上裂解下來(lái)，可以通過(guò)在外源蛋白的起始區(qū)加入一段連接肽，比如在這個(gè)系統(tǒng)中已經(jīng)表達(dá)成功的GFP的一段起始蛋白序列來(lái)幫助目的蛋白從融合蛋白上成功裂解。

體外酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示，通過(guò)pET32a-scFv-His/BL21(DE3)低溫表達(dá)后純化獲得的目的蛋白與CTGF/CCN2的結(jié)合具有良好的特異性。接下來(lái)的工作，我們將進(jìn)一步觀察這個(gè)抗體蛋白在動(dòng)物小鼠模型體內(nèi)的抗纖維化活性，這將是目前已有研究中首次報(bào)道用CTGF的scFv抗體治療纖維化疾病。因?yàn)榇藄cFv抗體來(lái)源于人類(lèi)自身抗體庫(kù)，在人體中不會(huì)引發(fā)抗原抗體反應(yīng)，如果活性良好，將有望成為首個(gè)能應(yīng)用于臨床的治療肺纖維化的抗體藥物。

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