磁柱分選技術(shù)在CMV特異性CD8+T細(xì)胞純化中的應(yīng)用研究

王新超，張偉，邸旭，姜智，陳寶安

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.天津醫(yī)科大學(xué)四中心臨床學(xué)院腫瘤外科，天津 300140;3.江蘇省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，江蘇 南京 210009)

巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)疾病是同種異體外周血干細(xì)胞移植后常見并發(fā)癥和導(dǎo)致死亡的主要原因［1］。CMV特異性CD8+T細(xì)胞是阻止或限制CMV反應(yīng)的關(guān)鍵因素［2］，其過繼性免疫治療已經(jīng)用于CMV疾病的治療。獲得高純度的CMV特異性CD8+T細(xì)胞是過繼性免疫治療的關(guān)鍵。雖然CMV特異性CD8+T細(xì)胞體外培養(yǎng)或克隆技術(shù)能夠有效獲得高純度的 CMV 特異性 CD8+T 細(xì)胞［3－4］，但由于對技術(shù)和費用的要求較高而難以推廣。Cobbold等［5］應(yīng)用四聚體技術(shù)純化CMV特異性CD8+T細(xì)胞，雖然取得了較滿意的結(jié)果，但四聚體試劑隨細(xì)胞輸注入體內(nèi)可產(chǎn)生毒副作用。本實驗探索可否運用磁柱技術(shù)聯(lián)合連鎖狀多聚體既簡便又高效地純化CMV特異性CD8+T細(xì)胞，進(jìn)而用于CMV疾病的過繼性免疫治療。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

連鎖狀多聚體試劑(包括IS緩沖液、連鎖狀多聚體磁珠、D-Biotin、CMV連鎖狀多聚體PE和MHC等)由德國IBA公司提供，抗CD8*PerCP抗體由美國BD公司提供，分別儲存于4℃、－20℃和－80℃冰箱。Ficoll-Biocoll和RPMI 1640分離液由德國生物化學(xué)AG公司提供;人AB白蛋白由德國DRK公司提供;DPBS、青霉素和鏈霉素由美國Invitrogen公司提供;BD FACS沖洗液、清理液、浸潤液為德國BD公司產(chǎn)品;MACS濾片和MS磁柱為德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品。

1.2 血標(biāo)本

所有外周血標(biāo)本均由HLA-A2/CMV血清陽性健康志愿者提供。外周血單核細(xì)胞由Ficoll-Biocoll分離液從血標(biāo)本中分離獲得，經(jīng)過臺盼藍(lán)實驗證實其存活率大于95%。外周血單核細(xì)胞可以直接用于進(jìn)一步實驗，或冷凍后儲存于－80℃超低溫冷凍箱或液氮罐中備用。

1.3 分選前后CMV特異性CD8+T細(xì)胞的檢測

分選前外周血單核細(xì)胞標(biāo)本中的CMV特異性CD8+T細(xì)胞的百分比由流式細(xì)胞儀檢測，用抗CD8*PerCP抗體檢測CD8+T細(xì)胞，CMV連鎖狀多聚體PE檢測CMV特異性細(xì)胞。首先，將外周血單核細(xì)胞和HLA-A2/CMV連鎖狀多聚體PE在4℃、避光的條件下孵育45 min，HLA-A2/CMV連鎖狀多聚體PE的使用濃度為每106個細(xì)胞0.2 μg。其次，將抗CD8*Per-CP抗體和上述標(biāo)本在4℃、避光的條件下孵育20 min。用PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測，所有標(biāo)本至少收集106個細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析，每一個標(biāo)本都做對照實驗來定義所染細(xì)胞的屬性。為了避免死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片影響實驗結(jié)果，僅對淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.4 運用MS磁柱分選CMV特異性CD8+T細(xì)胞

首先運用CMV連鎖狀多聚體磁珠復(fù)合物標(biāo)記CMV特異性CD8+T細(xì)胞，之后運用MS磁柱將已標(biāo)記的細(xì)胞和未標(biāo)記的非特異性細(xì)胞分離，最后用D-Biotin試劑將連鎖狀多聚體試劑和CMV特異性CD8+T細(xì)胞分離，獲得CMV特異性CD8+T細(xì)胞。共可分為3部分。

第1部分，將50 μl連鎖狀多聚體磁珠、8 μl CMV連鎖狀多聚體MHC和90 μl IS緩沖液在4℃和避光條件下孵育45 min后加入1 ml IS緩沖液。將MS磁柱置于磁場中，用3 ml IS緩沖液沖洗，將上述孵育后的液體注入磁柱分選，未與磁珠結(jié)合的CMV連鎖狀多聚體MHC被洗脫，CMV連鎖狀多聚體MHC-磁珠復(fù)合物滯留于MS磁柱。接著，將MS磁柱移離磁場，加入250 μl IS緩沖液洗脫并收集CMV連鎖狀多聚體磁珠復(fù)合物。將上述CMV連鎖狀多聚體磁珠復(fù)合物與2×107的單核細(xì)胞在4℃和避光條件下外周血孵育45 min，洗滌細(xì)胞，加入1 ml IS緩沖液，準(zhǔn)備分選。

第2部分，將MS磁柱放入磁場，用3 ml IS緩沖液沖洗，將上述細(xì)胞懸液注入磁柱。然后，用1 ml IS緩沖液沖洗3次，未與CMV連鎖狀多聚體磁珠結(jié)合的細(xì)胞可通過磁柱。將磁柱移離磁場，用1 ml IS緩沖液沖洗3次，洗出已經(jīng)標(biāo)記的特異性細(xì)胞，收集備用。

第3部分，將上述與磁珠結(jié)合的細(xì)胞離心、混懸于2 ml IS緩沖液中，加入2 mmol·L－1D-Biotin在4℃和避光條件下孵育20 min后洗滌。重復(fù)上述步驟1次，之后用5 ml IS緩沖液洗滌4次，收集所得細(xì)胞進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本的選擇

為獲得CMV特異性CD8+T細(xì)胞含量較高的標(biāo)本，本實驗檢測了HLA-A2/CMV血清陽性健康志愿者的血標(biāo)本。結(jié)果顯示，53.3%的標(biāo)本中CMV特異性CD8+T細(xì)胞陽性，其中25%的標(biāo)本超過0.5%，將這些標(biāo)本儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 CMV特異性CD8+T細(xì)胞的純化率

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，外周血單核細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過分選后，CMV特異性 CD8+T細(xì)胞的純度最高達(dá)到90.45%(圖1)。經(jīng)過一次磁柱分選的CMV特異性CD8+T細(xì)胞的純度為72.33% ～78.95%，經(jīng)過兩次磁柱分選的純度為85.31% ～90.45%，后者的純度較前者明顯提高(表1)。但經(jīng)過兩次磁柱分選后，CMV特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量較僅進(jìn)行1次磁柱分選明顯減少。

圖1 運用MS磁柱從HLA-A2/CMV血清陽性健康志愿者血標(biāo)本中分選的CMV特異性CD8+T細(xì)胞Fig 1 Selection of CMV-specific CD8+T cells by MS column from a HLA-A2/CMV-seropositive healthy donor The dot plots show the percentage of CMV specific CD8+T lymphocytes before(A)and after(B)selection.For subpopulations of T lymphocyte，frequency of CMV specific CD8+T lymphocytes was increased from 0.63%to 72.33%after MS selection

表1 CMV特異性CD8+T細(xì)胞的純度Tab 1 The purity of CMV specific CD8+T cells

3 討 論

CMV疾病是同種異體外周血干細(xì)胞移植常見并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［1］。目前，有兩種方法治療，一種是抗病毒藥物治療，另一種是免疫治療［6－7］。抗病毒藥物治療發(fā)展較早，但隨著藥物毒性和抗藥病毒的出現(xiàn)，其療效已經(jīng)受到影響［8］。因此，CMV特異性CD8+T細(xì)胞的過繼性免疫治療受到關(guān)注。研究證明，純化的CMV特異性CD8+T細(xì)胞不僅可以誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)，而且可以避免移植物抗宿主反應(yīng)［3］。目前，有兩類方法用于獲取CMV特異性CD8+T細(xì)胞:一類是細(xì)胞克隆技術(shù)，其價格昂貴、技術(shù)復(fù)雜，難以推廣;另一類直接從外周血中提純抗原特異性CD8+T細(xì)胞，目前有一定的進(jìn)展［5］，但試劑卻和細(xì)胞牢固結(jié)合，可能導(dǎo)致相應(yīng)的并發(fā)癥。

連鎖狀多聚體技術(shù)能夠鑒別CMV特異性CD8+T細(xì)胞，為CMV疾病的診斷和治療拓展了發(fā)展空間［9］。CMV血清陽性健康志愿者的外周血中CMV特異性CD8+T細(xì)胞含量相當(dāng)高，本實驗檢測結(jié)果顯示，CMV特異性CD8+T細(xì)胞在53.3%的標(biāo)本中陽性表達(dá)。其中，25%的標(biāo)本中CMV特異性CD8+T細(xì)胞含量超過0.5%，使直接從外周血中分選CMV特異性CD8+T細(xì)胞成為可能［5］。連鎖狀多聚體技術(shù)的特點是能將已純化的CMV特異性CD8+T細(xì)胞和連鎖狀多聚體試劑分離，使純化的T細(xì)胞保持了原來的功能狀態(tài)［10］。其機理是:短肽鏈Strep-tags和strep-tactin具有高度親和性(Kd為1 ×10－6mol·L－1)，strep-tag Ⅱ和 strep-tactin的親和力是和抗生蛋白鏈菌素親和力的100倍［11］。在生理條件下，strep-tagⅡ可以和重組蛋白結(jié)合，用strep-tagⅡ和結(jié)合特異性磁珠的strep-tactin組成的MHC多聚體-磁珠復(fù)合物標(biāo)記抗原特異性T細(xì)胞，然后利用MS磁柱將已標(biāo)記的抗原特異性T細(xì)胞與其它細(xì)胞分離。D-Biotin與strep-tactin有更強的親和力(Kd＜1×10－13mol·L－1)，D-Biotin可以和 strep-tagⅡ競爭結(jié)合位點，將多聚體磁珠復(fù)合物從抗原特異性T細(xì)胞分離，從而得到具有功能活性的抗原特異性T細(xì)胞［12］。

MS磁柱技術(shù)具有簡單和實用的優(yōu)點，有利于分選抗原特異性T細(xì)胞［13］。本實驗探索聯(lián)合運用連鎖狀多聚體磁珠和MS磁柱，建立并優(yōu)化一個簡單、高效的獲得CMV特異性CD8+T細(xì)胞的方法。本實驗選用CMV特異性CD8+T細(xì)胞陽性表達(dá)的標(biāo)本，結(jié)果顯示:經(jīng)過1次磁柱分選的CMV特異性CD8+T細(xì)胞的純度最高達(dá)78.95%，經(jīng)過兩次磁柱分選的純度最高達(dá)到90.45%，經(jīng)過兩次磁柱分選的CMV特異性CD8+T細(xì)胞的純度明顯提高。提示磁柱分選技術(shù)效果良好，如果想得到高純度的CMV特異性CD8+T細(xì)胞，可采用兩次磁柱分選的方法。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過兩次磁柱分選較1次分選的細(xì)胞丟失嚴(yán)重。因此，我們可以根據(jù)對CMV特異性CD8+T細(xì)胞純度的要求不同，采用1次或兩次磁柱分選。

總之，聯(lián)合運用連鎖狀多聚體磁珠復(fù)合物和MS磁柱技術(shù)不僅可以得到高度純化的CMV特異性CD8+T細(xì)胞，而且連鎖狀多聚體試劑和磁珠可與細(xì)胞分離，進(jìn)而被洗脫、除去，這樣就避免了由試劑導(dǎo)致的副作用，如機體對試劑的免疫反應(yīng)、T細(xì)胞的定向移動功能的丟失等，有利于發(fā)展CMV特異性CD8+T細(xì)胞的過繼性免疫治療。

［1］LJUNGMAN P，BRAND R，EINSELE H，et al.Donor CMV serologic status and outcome of CMV-seropositive recipients after unrelated donor stem cell transplantation:an EBMT megafile analysis［J］.Blood，2003，102(13):4255-4260.

［2］GRIGOLEIT G U，KAPP M，HEBART H，et al.Dendritic cell vaccination in allogeneic stem cell recipients:induction of human cytomegalovirus(HCMV)-specific cytotoxic T lymphocyte responses even in patients receiving a transplant from an HCMV-seronegative donor［J］.J Infect Dis，2007，196(5):699-704.

［3］EINSELE H，ROOSNEK E，RUFER N，et al.Infusion of cytomegalovirus(CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy［J］.Blood，2002，99(11):3916-3922.

［4］PEGGS K，VERFUERTH S，MACKINNON S.Induction of cytomegalovirus(CMV)-specific T-cell responses using dendritic cells pulsed with CMV antigen:a novel culture system free of live CMV virions［J］.Blood，2001，97(4):994-1000.

［5］COBBOLD M，KHAN N，POURGHEYSARI B，et al.Adoptive transfer of cytomegalovirus-specific CTL to stem cell transplant patients after selection by HLA-peptide tetramers［J］.J Exp Med，2005，202(3):379-386.

［6］SCHMIDT G M，HORAK D A，NILAND J C，et al.A randomized，controlled trial of prophylactic ganciclovir for cytomegalovirus pulmonary infection in recipients of allogeneic bone marrow transplants;The City of Hope-Stanford-Syntex CMV Study Group［J］.N Engl J Med，1991，324(15):1005-1011.

［7］KOLB H J，SCHMID C，BARRET A J，et al.Graft-versus leukemia reactions in allogeneic chimeras［J］.Blood，2004，103(3):767-776.

［8］LANGSOTON A A，REDEIL C，ALIENDO A M，et al.Development of drug-resistant herpes simplex virus infection after haploidentical hematopoietic progenitor cell transplantation［J］.Blood，2002，99(9):1085-1088.

［9］YAO J，BECHTER C，WIESNETH M，et al.Multimer staining of CMVpp65 specific T cells for diagnosis and therapeutic purpose:a comparative study［J］.Clin Infect Dis，2008，46(10):96-105.

［10］NEUDORGER J，SCHMIDT B，HUSTER K M，et al.Reversible HLA multimers(Streptamers)for the isolation of human cytotoxic T lymphocytes functionally active against tumorand virus-derived antigens［J］.J Immunol Methods，2007，320(1-2):119-131.

［11］ VOSS S，SKERRA A.Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tagⅡpeptide and improved performance in recombinant protein purification［J］.Protein Eng，1997，10(8):975-982.

［12］KNABEL M，F(xiàn)RANZ T J，SCHIEMANN M，et al.Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer［J］.Nat Med，2002，8(6):631-637.

［13］KEENAN R D，AINSWORTH J，KHAN N，et al.Purification of cytomegalo-virus-specific CD8 T cells from peripheral blood using HLA-peptide tetramers［J］.Br J Haematol，2001，115(2):428-434.