γ δT細(xì)胞誘導(dǎo)與分化的初步研究-Ⅰ①

胡朝英 錢(qián) 柳 程偉志 黃秋愉 汪 萍 余奇文 張繼英 陳雪華 張冬青

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所,上海 200025)

人類γ δ T細(xì)胞據(jù)其δ鏈可分為δ 1和δ 2兩個(gè)亞群,δ 1亞群主要分布于外周器官的粘膜和皮下,在不同的組織部位,其數(shù)量不等;δ 2亞群主要存在于外周血中,占T淋巴細(xì)胞的0.5%～10%[1,2]。外周血中的γ δ T細(xì)胞約占人體總γ δ T細(xì)胞的90%以上,且主要取用Vγ 9Vδ 2 TCR基因片段,它能夠直接識(shí)別抗原分子而不受MHC分子限制,在固有免疫中發(fā)揮重要作用[3,4]。近年來(lái)γ δ T細(xì)胞是免疫學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其分化和功能進(jìn)行了廣泛深入的研究[5,6],但以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多見(jiàn),且集中在抗感染和抗腫瘤等方面[7,8],而有關(guān)人類γ δT細(xì)胞的亞型分化及免疫調(diào)節(jié)功能的研究尚處早期。本文旨在應(yīng)用異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate,IPP)誘導(dǎo)健康人外周血和新生兒臍帶血γ δT細(xì)胞擴(kuò)增,分析其不同亞型的分化格局,從而進(jìn)一步豐富對(duì)人類γ δ T細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí),為深入研究γ δT細(xì)胞與自身免疫病關(guān)聯(lián)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),更為應(yīng)用γ δT細(xì)胞干預(yù)自身免疫性疾病探索其可能性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)所用的人外周血細(xì)胞均來(lái)自本校健康學(xué)生志愿者,共15名,其中男8名,女7名;年齡18～35歲;新生兒臍帶血來(lái)自婦幼保健院足月自然分娩健康新生兒結(jié)扎剪斷臍帶后臍靜脈采血。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,BRL);胎牛血清(FBS,Gibco);IL-2(Roche);異戊烯焦磷酸(Sigma);結(jié)核桿菌多肽抗原(Mtb-Ag)由蚌埠醫(yī)學(xué)院李柏青教授惠贈(zèng);γ δ TCR,CD4,CD8磁珠分選試劑盒(Miltenyi Biotec);抗 CD3-FITC/PerCP,抗 γ δ TCR-PE,抗 γ 9-FITC,抗 δ 2-FITC/PE,抗 CD80/86-FITC,抗HLADR-PE/PE-Cy5,抗 CD69-PE,抗 CD27-PE,抗CD45RA/RO-PE-Cy5(所有熒光標(biāo)記單抗均購(gòu)自BD公司);淋巴細(xì)胞分離液(LymphoprepTM,Axis-shield)。1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分選 密度梯度離心法分離全血獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(CBMC)。部分PBMC經(jīng)γ δ TCR磁珠分選獲取γ δT細(xì)胞(純度大于90%),用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞;余陰選細(xì)胞經(jīng)CD4和CD8磁珠分選去除CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞后,用于增殖實(shí)驗(yàn)的輔佐細(xì)胞。部分PBMC和全部CBMC用于流式分析細(xì)胞表型和細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將磁珠分選得到的γ δT細(xì)胞用含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成1×106ml-1,加入 96孔培養(yǎng)板,每孔 100 μ l;含或不含 IL-2(20 U/ml)、不同濃度的 IPP(0.08 、0.8、3.2、8.0、20、80.0 μ g/ml)或 Mtb-Ag(20.0 μ g/ml)[9]的 RPMI1640培基每孔50 μ l;將輔佐細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成4×105ml-1,每孔 50 μ l,37℃、5%CO2 飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)。6天后加入3[H]-TdR 1μ Ci/孔,繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)后,收集細(xì)胞,β液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定3[H]-TdR摻入量,結(jié)果以每分脈沖數(shù)(cpm)表示。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將PBMC和CBMC分別用含10%FBS、IL-2(5 U/ml)和最佳濃度IPP的 RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成1×106ml-1,加入24孔培養(yǎng)板,每孔1 ml,37℃、5%CO2飽和濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.4 γ δ T細(xì)胞誘導(dǎo)前后的表型分析 流式細(xì)胞術(shù)分析γ δ T細(xì)胞在健康人外周血和新生兒臍帶血T細(xì)胞中的比例、Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞亞群在 γ δ T 細(xì)胞中的分布及其亞型;檢測(cè)IPP誘導(dǎo)后γ δ T細(xì)胞的比例,同時(shí)分析Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞的亞型和表型變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果使用BD CellQuest軟件進(jìn)行分析。

圖1 外周血和臍帶血γ δT細(xì)胞數(shù)量及亞群的異質(zhì)性Fig.1 The heterogeneity of γ δT cells in the quantity and subgroups between peripheral blood and cord blood

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均使用Prism(Graph-Pad)軟件進(jìn)行分析。用雙側(cè)配對(duì) t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)值進(jìn)行比較;用方差分析處理組內(nèi)數(shù)據(jù);將P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并在圖中進(jìn)行標(biāo)注(*.0.01＜P＜0.05;**.0.001＜P＜0.01;***.P＜0.001)。

2 結(jié)果

2.1 外周血和臍帶血γ δT細(xì)胞數(shù)量及亞群的異質(zhì)性 外周血 γ δ T細(xì)胞比例明顯高于臍帶血 γ δT細(xì)胞的比例,前者為6.161±1.456,后者為1.644±0.307,兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A);外周血和臍帶血Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞亞群比例差異顯著(17.98±6.07,91.39±6.67)且其各亞型分布格局不同(圖1B、C)。2.2 IPP誘導(dǎo)γ δ T細(xì)胞的擴(kuò)增存在劑量依賴 微量濃度IL-2具有協(xié)同IPP對(duì)γ δT細(xì)胞的促增殖作用。IPP誘導(dǎo)γ δ T細(xì)胞增殖效能以2 μ g/ml協(xié)同微量IL-2(5 U/ml)作用最顯著。如圖2所示。

圖2 IPP誘導(dǎo)γ δT細(xì)胞擴(kuò)增呈劑量依賴Fig.2 IPP-induced expansion of γ δT cells is dose-dependent

2.3 IPP對(duì)臍帶血γ δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 在 IPP作用下,外周血 γ δT細(xì)胞比例明顯增高,且大部分Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞被活化成效應(yīng)記憶型(CD27-CD45RA-);IPP同樣誘導(dǎo)臍帶血γ δT細(xì)胞擴(kuò)增,但不同的是Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞雖趨向中央記憶型(CD27+CD45RA-)和效應(yīng)記憶型(CD27-CD45RA-)分化,但仍以幼稚型(CD27+CD45RA+)為主,見(jiàn)圖3。

2.4 IPP活化的外周血Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞特征 被IPP活化的外周血Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞的特征之一在于高表達(dá)HLA-DR和 B7分子(圖4)。而臍帶血Vγ 9Vδ 2 T細(xì)胞表面HLA-DR和B7分子也有一定程度的表達(dá)。

圖3 IPP對(duì)γ δT細(xì)胞的誘導(dǎo)作用Fig.3 γ δT cells induced with IPP

圖4 IPP活化的外周血Vγ 9V δ 2 T細(xì)胞表型特征Fig.4 The phenotype characteristic of PB V γ 9Vδ 2 T cells activated by IPP

3 討論

人類γ δ T細(xì)胞根據(jù)其TCRγ、δ鏈的不同組合可分為多個(gè)亞群,由于其亞群的異質(zhì)性而呈現(xiàn)了不同的生物學(xué)特性[3,10]。最初人們對(duì)γ δ T細(xì)胞的認(rèn)識(shí)只限于其在固有免疫中的作用,然而自上個(gè)世紀(jì)八、九十年代,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)γ δT細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中同樣扮演著重要的角色。因此對(duì)于γ δ T細(xì)胞的定義,就有“第一道防線”,“調(diào)節(jié)細(xì)胞”或“先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的橋梁”等,但這些都只是描述了其復(fù)雜行為的某一層面[11]。事實(shí)上,在胸腺和外周組織中,γ δ T細(xì)胞的發(fā)育受其它免疫活性細(xì)胞的影響,形成了一個(gè)具有獨(dú)特生物學(xué)特征的淋巴細(xì)胞亞群系統(tǒng),對(duì)健康組織、免疫細(xì)胞,病原體持續(xù)感染的組織以及宿主對(duì)病原體的免疫應(yīng)答都有很多直接或間接的影響。近年來(lái),γ δT細(xì)胞具有的專職性抗原遞呈細(xì)胞的特性已成為人們研究的熱點(diǎn)。Moser等研究了人扁桃體來(lái)源的γ δT細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其具有專職性抗原遞呈細(xì)胞的表型和功能[12,13];隨后國(guó)內(nèi)外科學(xué)家陸續(xù)在小鼠和牛的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象[14,15]。此外 ,γ δT細(xì)胞通過(guò)分泌 IL-17、IFN-γ等細(xì)胞因子在感染性疾病和腫瘤中的作用也再次受到關(guān)注[16-18]。目前發(fā)現(xiàn)γ δT細(xì)胞在感染免疫、自身免疫和腫瘤免疫中都發(fā)揮著重要的作用[19,20],可見(jiàn)γ δT細(xì)胞是一種“全能細(xì)胞”,與人類的很多疾病都有或多或少的聯(lián)系,有很大的研究空間和臨床價(jià)值。

由于γ δT細(xì)胞在外周血中數(shù)量很少,為我們深入研究其分化過(guò)程和生物學(xué)功能帶來(lái)一定困難,目前已有多種擴(kuò)增外周血中γ δT細(xì)胞的方法[21,22],特別是何維教授的課題組成功建立了一例健康人γ δT細(xì)胞的克隆[23]。本課題組一直致力于應(yīng)用臍帶血為 γ δ T 細(xì)胞的來(lái)源,尤其是研究 γ δT 細(xì)胞的分化 。若能從新生兒臍帶血擴(kuò)增出γ δ T細(xì)胞必將為我們提供豐富的細(xì)胞來(lái)源,為進(jìn)一步研究γ δT細(xì)胞奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文通過(guò)對(duì)外周血和臍帶血中γ δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)活化擴(kuò)增,分析兩者的差異及其不同階段的表型特征,以期確定發(fā)揮抗原遞呈作用的主要亞型以及此亞型的其它生物學(xué)功能,為探索其與臨床疾病的關(guān)聯(lián)性打下基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外周血和臍帶血γ δ T細(xì)胞在數(shù)量、亞群諸方面都有明顯的差異,且二者對(duì)IPP的反應(yīng)性不同。外周血γ δ T細(xì)胞被有效地活化成效應(yīng)記憶型的同時(shí),高表達(dá)抗原遞呈相關(guān)的表面分子。由于臍帶血來(lái)源的γ δT細(xì)胞主要是幼稚型細(xì)胞,在體外培養(yǎng)過(guò)程中,仍需相關(guān)細(xì)胞因子(如:IL-7、IL-15等[24,25])的協(xié)同作用,才能完全呈現(xiàn)出其分化成熟為可用于理論研究和臨床實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)記憶型γ δ T細(xì)胞的潛能。

本文旨在報(bào)道我們對(duì)γ δ T細(xì)胞分化和表型分析的前期研究,為深入研究γ δ T細(xì)胞的功能,尤其是其抗原遞呈作用做一鋪墊,更為將γ δT細(xì)胞用于免疫調(diào)節(jié)和干預(yù)自身免疫病與腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

真誠(chéng)感謝蚌埠醫(yī)學(xué)院李柏青教授的指導(dǎo)和惠贈(zèng)結(jié)核桿菌多肽抗原(Mtb-Ag)。

1 Fischer S,Scheffler A,Kabelitz D.Activation of human gamma delta T-cells by heat-treated mistletoe plant extracts[J].Immunol Lett,1996;52(2-3):69-72.

2 胡朝英,張冬青.γ δ T細(xì)胞的專職性抗原遞呈作用[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2008;31(3):344-348.

3 Beetz S,Wesch D,Marischen L et al.Innate immune functions of human gammadelta T cells[J].Immunobiology,2008;213(3-4):173-182.

4 Kabelitz D,Glatzel A,Wesch D.Antigen recognitionby human gammadelta T lymphocytes[J].Int Arch Allergy Immunol,2000;122(1):1-7.

5 Dieli F,Poccia F,LippM et al.Differentiation of effector/memory Vdelta2 T cells and migratory routes in lymph nodes or inflammatory sites[J].J Exp Med,2003;198(3):391-397.

6 Ferlazzo V,Sferrazza C,Caccamo N et al.In vitro effects of aminobisphosphonates on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and differentiation[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2006;19(2):309-317.

7 Gong F,Ma Y H,Ma A L et al.A lectin from Chinese mistletoe increases γ δT cell-mediated cytotoxicity through induction of caspase-dependent apoptosis[J].Acta Biochim Biophys Sin,2007;39(6):445-452.

8 Ma Y H,Cheng W Z,Gong F et al.Active chinese mistletoe lectin-55 enhances colon cancersurveillance through regulating innate and adaptive immune responses[J].World J Gastroenterol,2008;14(34):5274-5281.

9 陳 勇,呂合作,李柏青 et al.純化的結(jié)核桿菌多肽抗原刺激人γ δ T細(xì)胞的效應(yīng)分析[J].分子與細(xì)胞免疫學(xué),2004;20(10):661-664.

10 Hayday A C.[gamma][delta]cells:a right time and a right place for a conserved third way of protection[J].Annu Rev Immunol,2000;18:975-1026.

11 Born W K,Reardon C L,O'Brien R L.The function of gammadelta T cells in innate immunity[J].Curr Opin Immunol,2006;18(1):31-38.

12 BrandesM,Willimann K,Moser B.Professional antigen-presentation function by human gammadelta T cells[J].Science,2005;309(5732):264-268.

13 Moser B,Brandes M.Gammadelta T cells:an alternative type of professional APC[J].Trends Immunol,2006;27(3):112-118.

14 Lan C,Yan C,Hui S et al.Mouse γ δT cells are capable of expressing MHC classⅡmolecules,and of functioning as antigen-presenting cells[J].J Neuroimmunology,2008;203(1):3-11.

15 Collins R A,Werling D,Duggan S E et al.γ δT cells present antigen to CD4+α β T cells[J].J Leuko Bio,1998;63(6):707-714.

16 Roark C L,Simonian P L,Fontenot A P et al.gammadelta T cells:an important source of IL-17[J].Curr Opin Immunol,2008;20(3):353-357.

17 Umemura M,Kawabe T,Shudo K et al.Involvement of IL-17 in Fas ligand-induced inflammation[J].Int Immunol,2004;16(8):1099-1108.

18 Umemura M,Yahagi A,Hamada S et al.IL-17-mediated regulation of innate and acquired immune response against pulmonary Mycobacteriumbovis bacille Calmette-Guerin infection[J].J Immunol,2007;178(6):3786-3796.

19 Kabelitz D,Wesch D,He W.Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology[J].Cancer Res,2007;67(1):5-8.

20 高學(xué)平,宋秀宇,陳 勇 et al.γ δ T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性研究[J].腫瘤,2001;21(2):94-97.

21 陳復(fù)興,劉軍權(quán),馮 霞 et al.一種體外擴(kuò)增人γ δT細(xì)胞的新方法[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2007;23(7):662-664.

22 王克強(qiáng),侯彥強(qiáng),李 雁.一種簡(jiǎn)單快速擴(kuò)增和獲取外周血γ δT細(xì)胞的方法[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2004;12(3):372-374.

23 何小鵑,康寧,陳 慧 et al.一株健康人γ δT細(xì)胞克隆的建立及鑒定[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2009;29(1):24-28.

24 Laky K,Lewis J M,Tigelaar R E et al.Distinct requirements for IL-7 in development of TCRγ δcells during fetal and adult life[J].J Immunol,2003;170(8):4087-4094.

25 Rochman Y,Spolski R,LeonardW J.New insights into the regulation of T cells by γ c family cytokines[J].Nature Reviews Immunology,2009;9(7):480-490.