HIF-1α和VEGF在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的表達(dá)

徐育冬 宋新梅 靳洪濤 張紹君 (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,石家莊 050000)

血管新生在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合中是一個基本生理過程,但在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)、腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變和銀屑病等病理過程中也具有重要作用[1]。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在促進(jìn)滑膜局部血管新生中具有重要作用,血管增殖確保了滑膜血管翳的發(fā)生和成長,是RA發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié),并且促進(jìn)了軟骨和骨的破壞及關(guān)節(jié)重塑,最終造成關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直,功能喪失。關(guān)節(jié)炎動物實驗表明,在RA的過程中阻斷血管生成是一種有效的治療方法[2]。本實驗旨在觀察佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠(AA)膝關(guān)節(jié)滑膜VEGF、HIF-1α的表達(dá)。為RA滑膜血管翳形成尋找實驗證據(jù)及臨床抑制RA滑膜血管翳生成提供理論依據(jù)及有效切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 Wistar大鼠30只,雄性,體重140～160克,由河北省實驗動物中心提供,合格證號802120,許可證號SCXK(冀)2003-1-003。

完全弗氏佐劑(FCA,10 ml)購于Sigma公司;VEGF、HIF-1α免疫組化成套試劑盒購自深圳晶美生物制品公司;卡介苗(BCG,50 mg/支)購自華瑞創(chuàng)新生物科技開發(fā)中心。

1.2 分組及AA大鼠模型的建立 將30只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為2組,設(shè)正常對照組10只,造模組20只。將FCA與卡介苗配置為(含BCG 10 mg/ml)的水包油乳劑。試驗第一天造模組20只大鼠的尾根部皮內(nèi)注射該乳劑0.2 ml致炎,正常對照組大鼠的尾根部皮內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.3 病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測 于致炎后第28天,處死所有大鼠并取膝關(guān)節(jié)滑膜組織,置于4%多聚甲醛固定液中固定,以備作病理及免疫組織化學(xué)檢測。常規(guī)HE染色并計算滑膜病理積分,按照炎癥程度不同分別評分[3]:0分:正常;1分:極少炎性細(xì)胞浸潤或(和)組織輕微水腫;2分:輕微浸潤;3分:中等浸潤;4分:明顯浸潤;5分:嚴(yán)重浸潤。

免疫組化檢測用SABC(鏈霉親和素生物素酶復(fù)合物)法,HIF-1α和VEGF陽性滑膜細(xì)胞均呈顆粒狀棕黃色或棕褐色。采用真彩色圖像分析系統(tǒng)對HIF-1α和VEGF表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。方法[4]如下:每張切片隨機(jī)選取5個視野(×400),系統(tǒng)自動測量出陽性染色部位的積分光密度(IOD),5個視野的平均IOD值代表該切片HIF-1α和VEGF的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物入選情況 造模組大鼠共有11只大鼠造模成功,其間死亡1只。最后造模組入選大鼠10只。

2.2 大鼠滑膜病理學(xué)改變及病理學(xué)評分 見圖1、2。正常大鼠滑膜襯里層有1～2層滑膜細(xì)胞組成,且部分不連續(xù)?；ひr里層下層為由脂肪細(xì)胞、少量成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和少量血管組成的結(jié)締組織?；そM織無炎性細(xì)胞浸潤,無纖維組織增生。而AA大鼠可見滑膜組織中等量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤,平均病理積分3.8±0.45,滑膜襯里層增生達(dá)4～6層(表1)。

圖1 正常對照組(HE)(×400)Fig.1 The normal synovium(HE)(×400)

2.3 滑膜組織HIF-1和VEGF的表達(dá) 見圖3～6。正常對照組大鼠滑膜組織均有少量HIF-1和VEGF的表達(dá)。而造模組滑膜組織HIF-1和VEGF均明顯高于正常對照組(P＜0.01)(表2)。

圖2 模型對照組(HE)(×400)Fig.2 The hyperplastic synovium(HE)(×400)

表1 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理積分(±s)Tab.1 Histopathological integration of synovial membrane(±s)

表1 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理積分(±s)Tab.1 Histopathological integration of synovial membrane(±s)

Note:P＜0.01 compared with control group.

Groups n 28 d Control 10 0 AA 10 3.8±0.45

圖3 正常對照組VEGF表達(dá)(×400)Fig.3 The expression of VEGF of synoviumin normal rat(×400)

圖4 模型對照組VEGF表達(dá)(×400)Fig.4 The expression of VEGF of synoviumin AArat(×400)

圖5 正常對照組HIF-1α表達(dá)(×400)Fig.5 The expression of HIF-1αof synovium in normal rat(×400)

圖6 模型對照組HIF-1α表達(dá)(×400)Fig.6 The expression of HIF-1αof synovium in AA rat(×400)

表2 滑膜組織HIF-1α和 VEGF的積分光密度值(±s)Tab.2 IOD of HIF-1αand VEGF of synovium( ±s)

表2 滑膜組織HIF-1α和 VEGF的積分光密度值(±s)Tab.2 IOD of HIF-1αand VEGF of synovium( ±s)

Note:P＜0.01 compared with control group.

Groups n HIF-1α VEGF Control 10 176.74±50.95 192.71±14.22 AA 10 1 002.75±238.44 1 030.30±247.80

2.4 滑膜病理學(xué)評分與HIF-1和VEGF表達(dá)的相關(guān)性 滑膜組織病理積分與HIF-1α、VEGF的IOD值均成直線正相關(guān),分別為r=0.810(P＜0.01),r=0.778(P＜0.01)?；そM織HIF-1α和VEGF之間的IOD值成直線正相關(guān),r=0.890(P＜0.01)。

3 討論

HIF-1是促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵因子,可能在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用。HIF是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞氧平衡和缺氧反應(yīng)基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1α更為重要。HIF-1是缺氧狀態(tài)下血管生成的核心調(diào)控因子,通過調(diào)控其他因子的表達(dá),直接參與血管生成[5],而VEFG是血管生成初期關(guān)鍵性生長因子。HIF-1對VEFG調(diào)控表現(xiàn)為:①HIF-1能夠啟動VEGF轉(zhuǎn)錄;②缺氧時VEGF mRNA穩(wěn)定性增加;③HIF-1還可以上調(diào)VEGFR1轉(zhuǎn)錄,加強(qiáng)VEGF生物學(xué)效應(yīng)[6]。血管生成效應(yīng)主要是VEGF激活VEGFR2的結(jié)果。VEGF表達(dá)升高的主要原因是HIF-1α表達(dá)增加,通過與VEGF啟動基因內(nèi)的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合,使VEGF表達(dá)升高[1]。VEGF也是導(dǎo)致滑膜炎癥和血管生成的主要因子。VEGF的生理功能[7]:①促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管新生;②增強(qiáng)血管通透性,促進(jìn)血管內(nèi)物質(zhì)滲出,從而促進(jìn)慢性炎癥形成和發(fā)展。本實驗發(fā)現(xiàn)正常滑膜組織也少量表達(dá) HIF-1α和VEFG,提示 HIF-1α和 VEFG 在維持滑膜正常功能中起一定作用。而AA大鼠滑膜襯里層增生達(dá)4～6層,可見滑膜組織中等量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤。HIF-1α和VEFG的表達(dá)明顯高于正常對照組,且與病理學(xué)評分成直線正相關(guān),表明過度表達(dá)的HIF-1α和VEFG可能是滑膜炎癥發(fā)生和進(jìn)展過程中的重要的細(xì)胞因子,在滑膜血管翳的形成和滑膜增生中具有重要作用。HIF-1α和VEFG的表達(dá)呈直線正相關(guān),提示二者在滑膜血管的增生中可互相影響共同促進(jìn)滑膜血管翳的形成。細(xì)胞因子在RA發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要,是炎癥和損傷的重要遞質(zhì),在臨床治療RA能否抑制或拮抗關(guān)節(jié)滑膜局部HIF-1α和VEFG表達(dá),從而抑制滑膜血管翳增生及骨關(guān)節(jié)的破壞還有待深入研究,為臨床治療RA提供新思路。

1 Bouis D,Kusumanto Y,Meijer C et al.A review on pro-and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention[J].Pharmacol Res,2006;53:89-103.

2 Paleolog EM,Miotla JM.Rheumatoid arthritis:A target for antiangiogenic therapy?[J].Humana PressInc,2001;8(6):129-149.

3 張 晶,左曉霞,李 通 et al.沙利度胺對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其對炎性細(xì)胞因子的影響[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2005;9(11):656-659.

4 Peters C L,Morris C J,Mapp P I et al.The transcription factors hypoxiainducible factor 1αand ets-1 colocalize in the hypoxic synovium of inflamed joints in adjuvant-induced arthritis[J].Arthritis Rheumm,2004;50(1):291-296.

5 Gaber T,Dziurla R,Tripmacher R et al.Hypoxia inducible factor(HIF)in rheumatology:low O2!See what HIF can do![J].Ann Rheum Dis,2005;64:971-980.

6 DistlerK.Hypoxia and angiogenesis in rheumatic diseases[J].Z Rheumatol,2003;62(Suppl2):43-45.

7 Zachary I.VEGF signalling:integration and multi-tasking in endothelial cell biology[J].Biochem Soc Trans,2003;31:1171-1177.