降脂消斑片對兔動脈粥樣硬化模型主動脈與冠狀動脈粥樣硬化斑塊的影響

程丑夫 ，邱賽紅 ，程 屹 ，劉建和 ，龍 云 ，漆相和

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410007；3.岳陽相和化工科技有限公司，湖南 岳陽 410208）

降脂消斑片是根據湖南省名中醫(yī)程丑夫教授多年臨床實踐探索、總結獲得的治療高脂血癥及動脈粥樣斑塊有效的經驗方而開發(fā)的中藥新藥。該藥由虎杖、黃芪、大黃、當歸等藥物組成。具有化痰清熱，活血通脈，調節(jié)血脂，消退動脈斑塊功效。主治痰熱血瘀之高脂血癥、動脈粥樣斑塊形成。經初步的臨床觀察，證明該方在調節(jié)血脂，促進動脈粥樣斑塊消退方面有較好的臨床療效，且較長時間服用未見對機體有明顯不良影響。為了了解降脂消斑片調節(jié)血脂、治療動脈粥樣硬化的藥理作用,并對其作用機制進行探討,本項目研究采用兔制備動物高脂血癥合并動脈粥樣硬化模型,證實模型成立后，在繼續(xù)給予高脂飲食同時，觀察了降脂消斑片對此種動物模型的主動脈與冠狀動脈粥樣硬化斑塊的影響。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康大耳白兔，雄性。由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：湖南省醫(yī)學實驗動物管理委員會醫(yī)動字20-003號。實驗動物環(huán)境設施合格證號：湘醫(yī)動字20-001號。動物進入實驗室后，兔為單籠喂養(yǎng)。動物室光照充足，通風和空調設備良好?？照{保持室溫18～25℃，相對濕度50%～70%，實驗室按常規(guī)定期清潔、消毒。兔用基礎飼料由湖南中醫(yī)大學動物實驗中心按標準配方制備后提供。

1.1.2 藥物 降脂消斑片：采用不含輔料的干浸膏粉。每1 g干膏粉含生藥5.12 g。降脂消斑片推薦的每日臨床用量為20.6 g生藥/d（長沙華源醫(yī)藥科技公司提供，批號：060920）。辛伐他汀片：10 mg/片。適應于高脂血癥。臨床常用量為10～20 mg/d（上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司生產，批準文號：國藥準字Z19980054，生產批號060902）。脂降寧片：主要有山楂、制何首烏、氯鋇酸鋁等，功能行氣散瘀、活血通經、益精血、降血脂，主治胸痹心痛、眩暈耳鳴、肢體麻木、高脂血癥，或合并高血壓、冠心病、動脈硬化等的高脂血癥。 0.4g/片，臨床用量為 3～4片/次，3次/日（遼寧康博士制藥有限公司生產,批準文號：國藥準字Z19994081，生產批號 20060901）。

1.1.3 試劑 膽固醇（含量≥90%，淮北市創(chuàng)凱生化原料廠，批號：20060729）；蛋黃粉（安徽亳州紅日實業(yè)有限公司，批號：060706142）；現煉豬油為本地農貿市場所購；牛血清白蛋白（含量>98%，北京迪爾拜生物公司生產）；蘇丹紅Ⅳ （CR級，湖南湘中精細化學品廠生產，批號：20050216）；其余化學試劑均為市售AR級。

1.1.4 儀器 TF-1000型電子天平 （湘儀天平儀器廠生產）；FA104型電子分析天平 （上海精密科學儀器有限公司生產）；754型分光光度計 （上海第三分析儀器廠生產）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡 （德國LEICA公司生產）；MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（北京航空航天大學科學儀器廠生產）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立[1-3]（1）高脂飼料配方及制備 高脂飼料配方參照文獻介紹:膽固醇2%，豬油10%，蛋黃粉20%,基礎飼料68%。將豬油加熱溶解后,與膽固醇、蛋黃粉加入基礎飼料中拌勻，用飼料制粒機壓制成顆粒即可。（2）模型制備 健康日本大耳白兔，雄性，體質量1.5～1.9 kg。參照文獻方法,采用血管內皮免疫損傷加高脂飼料喂養(yǎng)方法制備家兔高脂血癥合并動脈粥樣硬化模型。動物稱質量、編號后，除留作正常組的動物外，其余動物造模第1天和第7天,每只動物分別從耳靜脈注射牛血清白蛋白，每次劑量均為250 mg/kg。同時開始以所制備的高脂飼料哺養(yǎng)。方法為每只動物每日上午給予高脂飼料50 g（含膽固醇 1 g，豬油 5 g，蛋黃粉10 g，基礎飼料 34 g）。 下午給予普通基礎飼料100 g。隔日喂養(yǎng)青菜葉50 g。自由飲水。

1.2.2 動物分組 至造模8周后，經隨機從模型組中抽檢動物，證實已有高脂血癥及主動脈明顯粥樣斑塊形成，此時將全部動物禁食14 h后從耳緣靜脈取空腹血測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，作為給藥前的血脂結果。造模動物按膽固醇高低分層，隨機分為6組。即：模型組(蒸餾水)、降脂消斑片高、中、低劑量組（下稱高、中、低劑量組）和陽性對照辛伐他汀與脂降寧組。每組11只。

1.2.3 給藥方法及劑量 給藥方法采用灌胃給藥。模型組和正常組給蒸餾水，其余各組分別給予相應濃度藥液。降脂消斑片高、中、低劑量組分別按 0.78、0.39、0.19 g/kg以降脂高中低劑量組給予降脂消斑片干膏粉藥液（分別相當于生藥量 4、2、1 g/kg），脂降寧 0.6 g/kg、辛伐他汀 2 mg/kg為陽性對照組。給藥體積均為10 mL/kg。每天1次，連續(xù)8周。每周稱體質量1次，根據新體質量調整給藥量。各造模動物繼續(xù)同法給予高脂飼料喂養(yǎng)，直至試驗結束。降脂消斑片推薦的每日臨床用量為生藥20.6 g/d。實驗所用干膏粉每克含生藥5.12 g，相當于干膏粉4.02 g。降脂消斑片藥效學實驗設高、中、低3個劑量組。將人用劑量按體質量及體表面積法折算，作為動物試驗用藥的依據。降脂消斑片及對照藥兔用藥劑量見表1。

表1 降脂消斑片對兔藥物劑量的設置

1.2.4 主動脈及心臟組織病理學檢查 主動脈病理學檢查：取主動脈弓約1.5 cm用10%甲醛溶液中固定。常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色。在光學顯微鏡下觀察主動脈壁形態(tài)結構。并采用MIAS醫(yī)學圖像處理系統(tǒng)進行主動脈內膜、斑塊厚度與中膜厚度測定。

1.2.5 心臟組織病理學檢查 取心臟組織常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色后在光鏡下進行病理學檢查。觀察各組心臟組織形態(tài)結構。按文獻[4]方法進行冠狀動脈病變程度分析。并觀察記錄50個冠狀小動脈血管內有脂質者數目，按下式計算冠狀小動脈粥樣斑塊發(fā)生率（IA）：

附：冠狀動脈病變程度判斷標準。0級：動脈內膜無脂質浸潤；0.5級：內膜有輕度脂質浸潤；1級：內膜斑塊占血管腔面積的1/4；2級：內膜斑塊占血管腔面積的1/2；3級：內膜斑塊占血管腔面積的1/2以上；4級：斑塊幾乎堵塞整個管腔。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數據使用SPSS 13.0 for Windows軟件進行處理。計量資料均以“±s”表示。計量組間比較采用T檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

造模后8周時，分別從正常組和模型組隨機抽取動物剖檢觀察，結果，正常對照組動物血脂正常，主動脈內膜平整、光滑，肝臟為棕褐色。造模動物總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)較正常對照組顯著升高。且主動脈內膜有乳白色的脂質粥樣斑塊。蘇丹紅Ⅳ染色后，主動脈弓、胸主動脈及各分支開口處可見凸起于內膜表面的斑塊被染為腥紅色。肝臟為棕黃色。表明家兔高脂血癥及動脈粥樣斑塊均已形成。故進行分組、給藥。試驗過程中，造模組和正常組均有部分動物死亡。其中造模動物注射牛血清白蛋白后次日有個別動物死亡。造模早期個別動物因拒食高脂飼料衰竭而死，部分動物因灌胃操作不慎造成死亡，其余死亡的動物均有腹瀉癥狀，觀察均可見肛門污穢，剖檢胃腸明顯脹氣。給藥前動物死亡數共有23只，給藥后共有14只。各組死亡動物數無明顯差異。

2.1 降脂消斑片對兔主動脈及心臟組織病理學的影響

對主動脈進行組織病理學檢查結果，正常組主動脈壁厚度較均勻，內膜結構完整。內皮細胞無損傷、脫落。內皮下無脂質沉積。模型組主動脈管壁厚度不一。內膜表面凹凸不平。可見明顯的粥樣斑塊形成，呈新月狀或圓弧狀向內膜凸起。內皮細胞損傷、脫落，內膜增生。內膜下可見大量泡沫細胞和少量細胞碎片。中膜平滑肌細胞呈不規(guī)則增生。各藥物治療組的上述病變均有不同程度的減輕。其中以降脂消斑片高、中劑量組和辛伐他汀組病變程度的減輕最為明顯。其內膜相對較平整、內皮細胞受損較輕、內膜下泡沫樣細胞堆積程度明顯減輕。其余各藥物組的病變程度也有較大的改善。采用MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分別從各標本斑塊最厚處測量，測定斑塊最大厚度和中膜厚度，并計算內膜、中膜比值。結果，各藥物治療組的斑塊厚度和內膜/中膜比值與模型組比較均有顯著性差異。提示各藥物均有減輕內膜粥樣斑塊形成的作用。結果見表2。

表2 降脂消斑片對兔主動脈斑塊程度的影響 （±s）

表2 降脂消斑片對兔主動脈斑塊程度的影響 （±s）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較☆P<0.01。

組 別正常組模型組辛伐他汀高劑量組中劑量組低劑量組脂降寧組劑量（g/kg）— —0.002 0.78 0.39 0.19 0.60 n 898981 1 10 PA（%）0 62.08±14.56☆36.46±12.88**35.74±6.20**37.81±13.08**40.22±10.01*48.35±11.36*最大斑塊厚度(μm)17.2±2.0 149.5±31.7☆75.7±27.1**67.3±17.4**75.2±15.8**90.1±18.7**99.4±40.5**內膜/中膜0.09±0.01 0.71±0.19☆0.36±0.15**0.34±0.13**0.36±0.10**0.43±0.11**0.47±0.19*

2.3 降脂消斑片對兔冠狀動脈病變程度及冠脈AS發(fā)生率(IA)的影響

取心臟組織切片后進行光鏡下組織形態(tài)學觀察結果，正常對照組各級冠狀動脈均管壁厚度均勻，內膜光滑、結構完整。內皮細胞無損傷。內膜下脂質沉積。模型組冠狀動脈及分支管壁增厚。冠脈內膜增生和泡沫細胞堆積，粥樣斑塊呈半月形或不規(guī)則丘狀向管腔突出，使管腔狹窄。多數擠占管腔面積的1/2以上，甚至管腔閉塞。按文獻[3]介紹的冠狀動脈病變分級標準，病變程度均在2級以上。冠狀小動脈粥樣斑塊發(fā)生率IA達69%。各藥物治療組均可不同程度減輕冠脈的脂質浸潤和粥樣斑塊程度，冠狀動脈病變計分減少。降脂消斑片和辛伐他汀的作用均較模型組有顯著差異。0.39 g/kg以上降脂消斑片及辛伐他汀組降低模型動物冠狀小A粥樣發(fā)生率IA的作用也有顯著性，降脂消斑片的作用隨劑量加大而增強結果。見表3。

3 討論

模型的制備是藥物研究中的重要環(huán)節(jié)。家兔是最常用于制備高脂血及As模型的動物，至今仍被廣泛采用。其優(yōu)點是對外源性膽固醇吸收率高，對高血脂的清除能力低，病變發(fā)展快而廣泛，可復制出與人相似的As病變。研究[5]證實，給家兔高脂飼料喂養(yǎng)的同時，靜脈注射異種蛋白牛血清白蛋白造成動物血管內壁免疫損傷，較單純高脂喂養(yǎng)所形成的AS更明顯，造模4周即形成嚴重的AS。粥樣硬化斑塊面積高達50.7%。因而該法目前在相關研究中被廣泛應用。本實驗中采用了免疫損傷加高脂飼料喂養(yǎng)的復合方法制備家兔的高脂血癥合并AS復合模型。

表3 降脂消斑片對兔冠狀動脈病變程度及冠脈AS發(fā)生率(IA)的影響 （±s）

表3 降脂消斑片對兔冠狀動脈病變程度及冠脈AS發(fā)生率(IA)的影響 （±s）

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較☆P<0.01。

組 別正常組模型組辛伐他汀組高劑量組中劑量組低劑量組脂降寧組劑量（g/kg）——0.002 0.78 0.39 0.19 0.60 n 898981 1 10冠狀動脈病變程度0 0.5 1 2 3 4 8 0 0 0 0 0 0 0 0 4 2 3 0 1 4 2 1 0 0 1 5 2 1 0 0 1 3 3 1 0 0 1 3 4 3 0 0 1 2 3 4 0冠脈病變計分0 2.89±0.93☆1.43±0.82**1.39±0.78**1.56±0.82**1.95±0.96*2.05±0.95 IA（%）0 69.1±6.9☆45.0±7.4**44.2±5.1**47.0±6.4*51.8±7.0 50.6±4.4

中醫(yī)古典醫(yī)籍中沒有“高脂血癥”和“動脈粥樣硬化”之名，但有關于類似病變及臨床表現的論述。按其臨床表現，高脂血癥合并As屬于中醫(yī)學“痰濁”、“血瘀”的范疇。系本虛標實之病。本虛主要是氣虛、陽虛、血虛、陰虛及肝腎不足。標實主要為痰凝、血瘀。治療宜痰瘀同治，輔以扶正[6]。近年來，隨著認識的不斷深入，針對炎癥貫穿于AS始終的病理特征，一些學者逐漸重視清熱解毒類藥物的使用[7-9]，并認為可能是中醫(yī)藥防治的重要靶點[10]。降脂消斑片在治則上兼顧痰、瘀、熱、虛，旨在通過化痰清熱，活血通脈，促使血脂下降、動脈斑塊消退。其立法和組方具有良好的中醫(yī)藥理論基礎，是其能獲得臨床療效的重要依據。

研究結果顯示，采用降脂消斑片治療后，此種模型的主動脈與冠狀動脈粥樣斑塊、及血管內膜的脂質浸潤程度均較模型組有明顯的減輕。表現為主動脈粥樣斑塊面積減少、斑塊厚度變薄；心臟組織冠脈血管出現粥樣斑塊的病變數量減少、程度減輕。表明降脂消斑片還具有抑制由高脂血癥所造成的動脈粥樣斑塊發(fā)生發(fā)展的作用。

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