大孔吸附樹(shù)脂精制純化淡竹葉總黃酮的研究

劉 明 吳啟南 邵 瑩

南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046

淡竹葉(Herba Lophatheri)為禾本科(Gramineae)植物淡竹葉(Lophatherumgracile Brongn.)的干燥莖葉。本品性寒，味甘、淡，歸心、胃、小腸經(jīng)，有清熱除煩，利尿的功效，用于熱病煩渴，小便赤澀淋痛，口舌生瘡等癥[1]。淡竹葉中含有大量的黃酮、多糖、內(nèi)酯、葉綠素、氨基酸、維生素和微量元素等成分，其中黃酮類(lèi)化合物具有較高的生物活性。大孔吸附樹(shù)脂是近十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)有機(jī)高分子聚合物吸附劑，其穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨(dú)特、不受無(wú)機(jī)物存在的影響、再生簡(jiǎn)便、解吸條件溫和、使用周期長(zhǎng)、成本較低。近年來(lái)被廣泛用于中藥成分的精制純化。本實(shí)驗(yàn)以淡竹葉乙醇提取液為對(duì)象，通過(guò)大孔樹(shù)脂的篩選實(shí)驗(yàn)，探索淡竹葉總黃酮純化精制的最佳工藝。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

HH-S型水浴鍋；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；AY220型電子分析天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；日本島津UV-2401型紫外分光光度計(jì)。

1.2 材料

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100080-200707。淡竹葉購(gòu)自浙江省磐安縣新渥陳仙芬中藥材購(gòu)銷(xiāo)站，產(chǎn)地浙江，批號(hào)：20090308；醫(yī)用酒精；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[2]

采用硝酸鋁一亞硝酸鈉比色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在507nm處測(cè)定。得蘆丁濃度C(mg／mL)與吸光度A的回歸方程式：A=11.905C+0.0044，R2=0.9994。線性范圍：8～48ug/ml。

2.2 供試品溶液的制備及測(cè)定

取淡竹葉約100g，石油醚脫脂，18倍量75%乙醇回流提取1.0h[3]，減壓濃縮至無(wú)醇味，加入適量蒸餾水稀釋?zhuān)o置過(guò)夜，3000rpm離心，上清液置250ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，作為供試液備用。移取供試液0.25ml置25ml量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“各加60%乙醇溶液使成6.0ml”起，依法測(cè)定吸光度，測(cè)得供試液中總黃酮含量為3.6689mg/ml。移取10ml供試液置蒸發(fā)皿中水浴揮干，恒重，測(cè)得供試液中總黃酮含量為135.3841mg/g。

2.3 樹(shù)脂性能考察

2.3.1 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

以乙醇濕法上柱。用95%乙醇溶液在柱上流動(dòng)清洗，不時(shí)檢出流出液至乙醇液與水混合（1:5）不呈白色混濁為止，然后以大量蒸餾水洗去乙醇至無(wú)醇味。

2.3.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附考察

取預(yù)處理的7種不同型號(hào)的樹(shù)脂20ml分別置100ml量瓶中，精密移取5ml提取液，加水稀釋至50ml，時(shí)時(shí)振搖，放置18h。濾過(guò)，濾液測(cè)定吸光度。濾渣中加入85%乙醇50ml，時(shí)時(shí)振搖，放置18h。濾過(guò)，濾液測(cè)定吸光度。移取50ml濾液置蒸發(fā)皿中水浴揮干，恒重。平行測(cè)定2份。按式（1）（2）（3）計(jì)算得表1。

表1 靜態(tài)吸附時(shí)不同樹(shù)脂對(duì)總黃酮的影響

2.3.3 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附考察

取預(yù)處理的樹(shù)脂20ml裝柱（15mm*300mm），精密移取5ml提取液上樣，靜置1h。用蒸餾水洗至無(wú)色，洗液測(cè)定其吸光度。加入85%乙醇溶液洗脫至無(wú)色，洗脫液測(cè)定吸光度。移取25ml洗脫液置蒸發(fā)皿中水浴揮干，恒重。平行測(cè)定2份。按式（1）（2）（3）計(jì)算得表2。

表2 動(dòng)態(tài)吸附時(shí)不同樹(shù)脂對(duì)總黃酮的影響

從表2和表3可以看出HP-20和D-101型大孔吸附樹(shù)脂吸附率和解吸率均較高，從節(jié)約成本角度，故選擇D-101大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.4 D-101型大孔樹(shù)脂精制純化淡竹葉總黃酮工藝參數(shù)考察

2.4.1 乙醇溶液洗脫雜質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)梯度考察

取預(yù)處理樹(shù)脂20ml裝柱，精密移取2ml提取液上樣，靜置1h。依次用水、10%、15%、20%、30%的乙醇溶液以2ml/min速度洗脫。洗脫液測(cè)定吸光度，移取15ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干，恒重。平行測(cè)定2份。按式（3）計(jì)算得圖1。

圖1 低濃度乙醇梯度洗脫總黃酮含量變化

由圖1可知，20%乙醇溶液洗脫液中總黃酮含量增加明顯，因此，選用15%乙醇溶液作為雜質(zhì)的洗脫溶液。

2.4.2 洗脫液體積分?jǐn)?shù)考察

取預(yù)處理樹(shù)脂20ml裝柱，精密移取2ml提取液上樣，靜置1h。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質(zhì)。分別用40%、50%、60%、75%、95%的乙醇溶液以2ml/min速度洗脫。洗脫液測(cè)定吸光度，精密移取40ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干，恒重。平行測(cè)定2份。按式（3）計(jì)算得圖2。由圖2可知，50%乙醇溶液洗脫黃酮的含量最高，因此，選用50%乙醇溶液為洗脫劑。

圖2 不同濃度乙醇洗脫總黃酮含量變化

2.4.3 上柱靜態(tài)吸附時(shí)間考察

取預(yù)處理樹(shù)脂20ml裝柱，精密移取2ml提取液上樣，分別靜置15min、30min、60min、90min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質(zhì)。用50%乙醇溶液洗脫，洗脫液測(cè)定吸光度。洗脫速度均為2ml/min。精密移取25ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干，恒重。平行測(cè)定2份。按式（1）（2）（3）計(jì)算得表3。由表3可知，60min處的吸附率和解吸率均較高，且其黃酮含量也較高，綜合考慮選擇60min為上柱靜態(tài)吸附時(shí)間。

表3 上柱靜態(tài)吸附時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

2.4.4 洗脫液體積考察

取預(yù)處理樹(shù)脂10ml裝柱，精密移取4ml提取液上樣，靜置60min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質(zhì)，50%乙醇溶液洗脫。洗脫速度均為2ml/min。每1～2個(gè)樹(shù)脂體積收集一份洗脫液，精密移取測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：5倍量蒸餾水，5倍量15%乙醇溶液，6倍量50%乙醇溶液洗液中總黃酮含量均分別接近于零。因此，可確定上述條件為最佳洗脫體積。

2.4.5 樹(shù)脂重復(fù)上樣次數(shù)考察

取預(yù)處理樹(shù)脂10ml裝柱，精密移取3ml提取液上樣，靜置60min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質(zhì)，50%乙醇溶液洗脫。洗脫速度均為2ml/min。洗脫液測(cè)定吸光度，精密移取一定體積水浴蒸干，恒重。平行測(cè)定2份。用95%乙醇溶液洗滌至與水1:5混合不渾濁，用蒸餾水洗至無(wú)醇味。重復(fù)上樣操作4次。4次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：吸附率和解吸率均無(wú)明顯變化，而總黃酮含量不降反升，其中原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。說(shuō)明該型號(hào)樹(shù)脂重復(fù)使用率較高。

2.4.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取預(yù)處理樹(shù)脂10ml裝柱，精密移取3ml提取液上樣，靜置60min。用蒸餾水和15%乙醇溶液洗脫雜質(zhì)，50%乙醇溶液洗脫。洗脫速度均為2ml/min。洗脫液吸光度，精密移取10ml置蒸發(fā)皿中水浴揮干，恒重。平行測(cè)定2份。測(cè)得吸附率為81.58%，解吸率為78.08%，總黃酮含量為315.42mg/g。

3 討論

通過(guò)大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)吸附考察，確定D-101型大孔吸附樹(shù)脂比較適合于淡竹葉總黃酮的精制純化。工藝條件為：上柱保持60min，2ml/min速度洗脫，5倍量水、5倍量15%乙醇溶液洗脫雜質(zhì)、6倍量50%乙醇溶液洗脫?？傸S酮的純度由原來(lái)的135.38mg/g上升至315.42mg/g。其結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)該條件可行，可以作為工業(yè)生產(chǎn)的參考工藝條件。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊(cè))[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977：2253-2254.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄28.

[3]宋秋燁，陳梅，吳啟南.淡竹葉總黃酮提取工藝研究[A].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(3)：14.