膿毒癥時(shí)各型一氧化氮合酶在大鼠心臟中的表達(dá)及其可能機(jī)制

陳艷明,陳 琪,王士雯

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染及大手術(shù)等多種應(yīng)激狀態(tài)時(shí)的常見并發(fā)癥,其發(fā)病率和死亡率居高不下,而心功能不全在膿毒癥早期就可出現(xiàn),并且與預(yù)后密切相關(guān)。膿毒癥時(shí)心功能的降低是多種因素累加的結(jié)果,包括氧化磷酸化脫偶聯(lián),細(xì)胞產(chǎn)生高能磷酸鹽的能力降低;心肌冬眠;循環(huán)抑制因子TNF-α激活心臟中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS),產(chǎn)生大量 NO[1]。但膿毒癥時(shí)各型NOS表達(dá)及可能作用尚不明確。本研究擬對(duì)此進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性Wistar大鼠(250～350 g),由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？俁NA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自北京Tianwei公司。兔抗大鼠內(nèi)皮型NOS(eNOS)、兔抗大鼠神經(jīng)元型NOS(nNOS)、兔抗大鼠誘導(dǎo)型NOS(iNOS)均購(gòu)自武漢 Boster公司。

1.2 膿毒癥模型建立 30只大鼠,分別腹腔注射生理鹽水和LPS(10 mg/kg)各0.2 ml,形成對(duì)照組和LPS組。給藥6h后取組織備用。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 膿毒癥模型的建立同前。Wistar大鼠以烏拉坦(1 g/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,用充盈0.4%肝素鹽水的PE50管向心性插入動(dòng)脈,連接多道生理記錄儀檢測(cè)心電和血壓變化。穩(wěn)定30 min后向前推進(jìn)導(dǎo)管至左心室并固定導(dǎo)管,穩(wěn)定10 min后記錄左心室內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù),包括心率(heart rate,HR)、等容收縮期左室內(nèi)壓力最大上升速率(+dp/dtmax)、等容舒張期左室內(nèi)壓力最大下降速率(-dp/dtmax)等的改變。

1.4 NOS活性測(cè)定 按照南京生物建成技術(shù)公司生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書測(cè)定的結(jié)構(gòu)型NOS(constitutive NOS,cNOS)及誘導(dǎo)型(inducible NOS,iNOS)。

1.5 各型NOS的表達(dá)

1.5.1 半定量RT-PCR T rizol試劑提取RNA 紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。TIAN Script MMLV合成cDNA 第一鏈,總反應(yīng)體系25 μ l,反應(yīng)物用于PCR。利用 DNAclub軟件設(shè)計(jì)各型NOS和 GAPDH 的引物。nNOS:上游 5′-GTCTTCCACCAGGAGATG-3′,下 游 5′-AAAGGCACAGAAGTGGGGGTA-3′,擴(kuò)增長(zhǎng) 度 618bp;eNOS[1]:上 游 5′-TCCAGTAACACAGACAGTGCA-3′,下 游5′-CAGGAAGTAAGTGAGAGC-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度 693bp;iNOS:上游 5′-GAGATCAATGCAGCTGTG-3′,下游5′-AGAATGGAGATAGGACGT-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度 217bp;GAPDH:上游:5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCG-3′,下游:5′-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度443 bp。nNOS PCR反應(yīng)條件為94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 1 min,35個(gè)循環(huán);eNOS和iNOS PCR反應(yīng)條件為95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,34個(gè)循環(huán)數(shù);GAPDH PCR反應(yīng)條件為94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,25個(gè)循環(huán)數(shù)。取5 μ l PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)各型NOS/GAPDH,進(jìn)行半定量測(cè)定。

1.5.2 Western blot測(cè)定各型NOS蛋白的表達(dá)心肌加入蛋白裂解液勻漿,取上清,紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度,其余上清液分裝后置于-70℃保存。將樣品100℃沸水中加熱變性10 min,1000 g短暫離心后,進(jìn)行蛋白質(zhì)聚丙烯酸胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將轉(zhuǎn)有蛋白的硝酸纖維素膜置于5%脫脂牛奶中室溫下封閉1 h。剪切相應(yīng)蛋白條帶并分別加入兔抗大鼠nNOS、iNOS和eNOS多克隆抗體,4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次,分別加入山羊抗兔堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶1000稀釋),室溫孵育1 h。TBST洗膜3次后用NBT/BCIP顯色液顯色。特異性條帶的光密度值采用上海天能科技有限公司GIS像分析系統(tǒng)處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism-4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間差異比較采用組間t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥時(shí)大鼠心臟功能的變化 注射 LPS 6 h后,大鼠平均動(dòng)脈血壓明顯下降,心率增加(P＜0.05);反映左心室收縮和舒張功能的指標(biāo)(±dp/dt)下降明顯,分別較基礎(chǔ)狀態(tài)下降了20.9%和18.3%(P＜0.05;表1)。

2.2 心肌組織NOS活性測(cè)定 基礎(chǔ)條件下,成年大鼠心臟總NOS(total NOS)的活性為(0.45±0.17)U/mg蛋白質(zhì),其中iNOS的活性較弱,cNOS(包括eNOS和nNOS)活性較高;給予LPS處理后,心臟總NOS活性未見明顯變化,iNOS的活性明顯升高,是基礎(chǔ)狀態(tài)的4倍(P＜0.01),cNOS的活性較基礎(chǔ)狀態(tài)減少了27.5%(P＜0.05;圖1)。

2.3 心臟中各型NOS mRNA的表達(dá) 正常情況下,成年大鼠心臟中存在 eNOS mRNA和nNOS mRNA的表達(dá),其中eNOS mRNA的含量高于nNOS mRNA,正常成年大鼠心臟組織中未能檢測(cè)到iNOS mRNA的表達(dá);給予 LPS 6 h后 iNOS mRNA的含量明顯上升,nNOS和eNOS mRNA的含量減少(表2,圖2)。

表1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)定(n=15±s)

表1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)定(n=15±s)

注:HR:心率;MAP:平均動(dòng)脈壓;與對(duì)照組比較,*P＜0.05

組別 HR(次/min) MAP(mmHg) +dp/dtmax/(mmHg/s) -dp/dtmax/(mmHg/s)對(duì)照組 363±24 125±4 8200±1440 -6000±1230脂多糖組 430±15* 114±5* 6400±1320* -4900±850*

表2 大鼠心肌組織中各型NOS mRNA的表達(dá)(n=15±s)

表2 大鼠心肌組織中各型NOS mRNA的表達(dá)(n=15±s)

注:eNOS:內(nèi)皮型一氧化氮合酶;nNOS:神經(jīng)元型一氧化氮合酶;iNOS:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

NOS mRNA/GAPDH mRNA組別eNOS nNOS iNOS對(duì)照組 0.90±0.250.30±0.05 0.05±0.01脂多糖組 0.70±0.16*0.10±0.02** 0.40±0.02**

2.4 心臟各型NOS的蛋白表達(dá) 在正常情況下,心肌組織存在cNOS(含nNOS和eNOS)的蛋白表達(dá),但nNOS的蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于eNOS的表達(dá)量。給予大鼠LPS 6 h后,nNOS和eNOS的蛋白表達(dá)量下降(P＜0.05)。正常情況下,心肌組織可見極少量iNOS的表達(dá),給予LPS 6 h后,iNOS的表達(dá)量明顯增加(P＜0.01;表3,圖3)。

表3 大鼠心肌組織中各型NOS蛋白表達(dá)(n=15±s)

注:eNOS:內(nèi)皮型一氧化氮合酶;nNOS:神經(jīng)元型一氧化氮合酶;iNOS:誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 eNOS/β-actin nNOS/β-actin iNOS/β-actin對(duì)照組 0.85±0.25 0.25±0.05 0.05±0.01脂多糖組 0.65±0.20*0.10±0.02**0.60±0.10**

圖3 心臟各型NOS的蛋白表達(dá)

3 討 論

本研究證實(shí)膿毒癥時(shí)心血管功能受損,如心室收縮、舒張功能下降、血壓下降。內(nèi)毒素注入體內(nèi)后可產(chǎn)生明顯的心血管抑制作用,而體外實(shí)驗(yàn)缺乏相應(yīng)的抑制作用,提示內(nèi)毒素通過(guò)產(chǎn)生內(nèi)源性物質(zhì)介導(dǎo)該損傷作用[2]。

NOS分為3種亞型:nNOS,iNOS和eNOS;其中eNOS和nNOS又統(tǒng)稱cNOS,是許多正常組織中基本存在的一種酶,它為Ca2+/鈣調(diào)素依賴型,合成及釋放NO量少,且cNOS合成的NO壽命極短。iNOS為非Ca2+依賴型,它能夠持續(xù)大量釋放NO。給予 LPS后iNOS的活性較基礎(chǔ)狀態(tài)增加4倍,cNOS的活性較弱,iNOS活性增加是產(chǎn)生和釋放大量NO的主要原因。

與NOS活性變化一致,給予LPS 6 h后,大鼠心肌組織iNOS表達(dá)明顯增多(P＜0.01);eNOS和nNOS的表達(dá)均明顯減弱。敲除iNOS基因和應(yīng)用iNOS阻斷劑后,可恢復(fù)心血管系統(tǒng)對(duì)兒茶酚胺的敏感性[3];但是應(yīng)用NOS阻斷劑SMT、L-Nil和546C88反而增加膿毒癥的死亡率[4],提示膿毒癥時(shí)不僅iNOS在器官損傷中發(fā)揮作用,cNOS也可能發(fā)揮一定作用。

生理?xiàng)l件下,eNOS催化產(chǎn)生的NO可以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入血管腔,發(fā)揮抑制白細(xì)胞附壁、聚集的作用。膿毒癥時(shí),心肌血管內(nèi)白細(xì)胞附壁能力增強(qiáng)、黏附分子表達(dá)增多、自由基生成增加和血小板聚集、附壁增多[5];膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞上過(guò)表達(dá)eNOS可防止心功能降低[6]。本研究表明,膿毒癥大鼠模型eNOS表達(dá)減少,提示其可能在心功能受損中發(fā)揮作用。nNOS首次發(fā)現(xiàn)時(shí)的組織細(xì)胞定位在神經(jīng)元細(xì)胞上。且發(fā)現(xiàn)它在心臟的交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)和心肌細(xì)胞上也有表達(dá)?；A(chǔ)條件下其表達(dá)量較eNOS少,并且給予 LPS處理后,心肌細(xì)胞nNOS的表達(dá)量進(jìn)一步減少。關(guān)于nNOS在心臟中的作用目前研究較少?；A(chǔ)條件下,nNOS產(chǎn)生的NO在心肌細(xì)胞對(duì)膽堿能和腎上腺能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)和肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[7]。基礎(chǔ)條件下nNOS主要在心肌細(xì)胞的胞漿和胞膜上表達(dá),膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞上nNOS的表達(dá)減少,提示nNOS產(chǎn)生NO減少也可能參與心肌細(xì)胞功能障礙。另外在對(duì)心臟功能調(diào)整過(guò)程中,各型NOS間存在相互調(diào)節(jié)[8],在同一疾病不同時(shí)間發(fā)揮著不同作用;這是一個(gè)龐大復(fù)雜的體系,因此在膿毒癥時(shí)各型NOS的作用值得進(jìn)一步研究。

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