原花青素對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的保護(hù)作用

董 娜 ,于 進(jìn),李 寰 ,陶 凌 ,王海昌,胡 濤

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)已成為治療冠心病的主要手段,但術(shù)后的再狹窄(restenosis,RS)率高達(dá)20%～30%,嚴(yán)重影響了PCI術(shù)的療效;盡管各國學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量基礎(chǔ)及臨床研究,但該問題仍未解決,已成為全球的研究熱點(diǎn)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)與RS的關(guān)系密切相關(guān),PCI術(shù)后VEC損傷的程度決定了新生內(nèi)膜的增厚程度,對(duì)RS的程度起著關(guān)鍵作用[2]。VEC損傷的原因很多,除了PCI術(shù)不可避免的機(jī)械損傷外,脂質(zhì)過氧化是一個(gè)重要機(jī)制;PCI術(shù)后導(dǎo)致血管局部發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理變化,誘導(dǎo)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷氧化酶,使血管局部生成過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,從而引起VEC的DNA損傷及細(xì)胞功能障礙[3,4]。因此,有效地阻斷ROS對(duì)VEC的損傷作用,盡快恢復(fù)VEC活性,加速VEC的修復(fù),是防治RS的重要途徑之一。原花青素為黃酮類化合物,存在于葡萄、松針、蘋果、高粱、櫻桃等多種植物中,具有廣泛的生物活性;近年來的研究發(fā)現(xiàn)其有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、預(yù)防心血管疾病等作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn),原花青素對(duì)心臟缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生的ROS具有濃度依賴性的抑制作用,可保護(hù)和修復(fù)由缺血再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷[6]。但其是否能作為抗氧化劑阻斷ROS對(duì)VEC的損傷尚未見報(bào)道。本研究通過應(yīng)用不同濃度的過氧化氫(H2O2)作為外源性ROS作用于培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)造成其脂質(zhì)過氧化損傷,觀察了原花青素是否具有減輕VEC脂質(zhì)過氧化損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 原花青素(成都康弘制藥有限公司惠贈(zèng));過氧化氫(Sigma公司);3H-TdR(中科院上海原子能研究所);DNA-prep染色試劑(Coulter公司);DMEM干粉細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone公司);流式細(xì)胞儀Elite ESP型(Coulter公司);CO2培養(yǎng)箱(Nuair公司);液體閃爍計(jì)數(shù)器 LS-6500(Beckmen公司);其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 HUVEC體外培養(yǎng) 取剖腹產(chǎn)術(shù)中無菌臍帶,進(jìn)行原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)[7]。用含100 g/L小牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代,實(shí)驗(yàn)采用3～5代細(xì)胞。免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原進(jìn)行細(xì)胞鑒定。細(xì)胞分組如下:對(duì)照組,10、20、50、100 mol/L H2O2組,1、5、10 mmol/L 原花青素組,1、5、10 mmol/L 原花青素+100 mol/L H2O2組,共11組。

1.33H-TdR摻入法測(cè)定H UVEC增殖 取同代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,用2.5 g/L胰蛋白酶消化,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml,將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔 100 μ l,8孔為一組,用含100 g/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)24 h后換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,調(diào)整其同步化后,換含100 g/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用常規(guī)方法測(cè)定cpm值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期 取同代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,用2.5 g/L胰蛋白酶消化,制成1×105/ml單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶,用含100 g/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)24 h后換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,換含100 g/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物,在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,用流式細(xì)胞儀測(cè)定并計(jì)算每瓶各時(shí)相細(xì)胞的比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件完成。結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示。兩組間及組間的兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)和多組均數(shù)的單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2對(duì)HUVEC增殖的影響3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)顯示,除 10 mol/L組外,20、50、100 mol/L H2O2各組 cpm值與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.01),且呈濃度依賴性。100 mol/L H2O2抑制H UVEC增殖作用最強(qiáng),倒置顯微鏡下見HUVEC變形,細(xì)胞間隙變寬,部分細(xì)胞脫落。據(jù)此選擇該濃度作為本實(shí)驗(yàn)損傷HUVEC的濃度(圖1)。

圖1 原花青素和H2O2對(duì)HUVEC增殖的影響

2.2 原花青素對(duì)H2O2損傷后H UVEC增殖的影響3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)顯示,不同濃度原花青素均可對(duì)抗H2O2對(duì)H UVEC的增殖抑制作用。加入1、5、10 mmol/L原花青素后,各組 cpm 值與100 mol/L H2O2組相比均顯著升高(P＜0.01)。且具有一定的濃度依賴性。而單純?cè)ㄇ嗨乇旧韺?duì)H UVEC增殖無影響(P＞0.05,圖1)。

2.3 原花青素和H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期時(shí)相顯示,H2O2組DNA合成期(S期)細(xì)胞所占百分比顯著低于對(duì)照組;DNA合成前期(G1期)細(xì)胞所占百分比較對(duì)照組增高,反映細(xì)胞增殖活力的增殖指數(shù)值降低,差異顯著(P＜0.05)。不同濃度原花青素均可對(duì)抗H2O2對(duì) HUVEC的DNA合成抑制作用,且具有一定的濃度依賴性。而單純?cè)ㄇ嗨乇旧韺?duì)HUVEC細(xì)胞周期無影響,各組細(xì)胞在不同周期時(shí)相與對(duì)照組比較均無顯著性差異(P＞0.05;表1)。

表1 原花青素和H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞周期的影響 (n=12 ±s)

表1 原花青素和H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞周期的影響 (n=12 ±s)

注:A:對(duì)照組;B,C,D,E:10,20,50,100 mol/L H2O2;F,G,H:100 mol/L H2O2+1,5,10 mmol/L原花青素。與對(duì)照組比較,*P＜0.05;與B組比較,#P＜0.05

分組 G1(%) S(%) 增殖指數(shù)A 62.5±3.8 31.9±2.8 37.5±3.2 B 85.5±2.7* 17.5±2.1* 14.5±2.3*C 63.2±2.5 27.1±0.8 36.8±2.4 D 61.6±3.6 28.2±2.2 38.4±2.1 E 62.2±2.4 27.7±2.4 37.8±2.8 F 77.9±1.5# 21.4±2.3# 22.1±1.7#G 68.4±2.7# 23.2±1.6# 31.6±2.2#H 61.4±3.4# 27.1±2.1# 38.6±3.4#

3 討 論

氧化應(yīng)激以及氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的過量ROS是PCI術(shù)后 RS發(fā)生的一個(gè)重要促進(jìn)因素。ROS除了能直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用外,還能通過影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控某些基因的表達(dá)。有研究顯示,PCI術(shù)后ROS產(chǎn)生增多,且同一血管的損傷段與未損傷段相比,前者ROS產(chǎn)生量是后者的2～3倍[8]。生理狀態(tài)下,VEC產(chǎn)生的各種收縮(促)生長因子與舒張(抑)生長因子處于平衡狀態(tài);從而調(diào)節(jié)血管的張力和血管平滑肌細(xì)胞生長。PCI術(shù)后ROS過度蓄積引起VEC脂質(zhì)過氧化損傷,平衡狀態(tài)被打破,是啟動(dòng)和促進(jìn)RS的重要原因[9]。

高脂血癥、糖尿病、高血壓和吸煙是公認(rèn)的RS發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因子,雖然其致病機(jī)制并不十分清楚,但近年研究顯示,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激信號(hào)選擇性誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因表達(dá)是它們共同的分子機(jī)制之一[10]。很多細(xì)胞因子和生長因子可誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS,通過Ras/ERK以及其他尚未闡明的信號(hào)通路激活靶基因,調(diào)控細(xì)胞增殖和分化,最終導(dǎo)致RS。越來越多的證據(jù)提示,ROS和一系列參與RS的活性因子相互促進(jìn)相互影響,在RS形成過程中可能起著關(guān)鍵性作用。利用藥物有效地阻斷ROS對(duì)VEC的損傷已成為近年來 RS防治的研究熱點(diǎn)[11,12]。

原花青素屬多羥基類化合物,其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具有很強(qiáng)的自由基清除能力。原花青素可以通過清除體內(nèi)過多的ROS,抑制脂質(zhì)過氧化,維持體內(nèi)自由基和抗氧化酶之間的平衡,與體內(nèi)各種抗氧化酶共同維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài),從而預(yù)防由于自由基或脂質(zhì)過氧化引起的各種疾病[13]。新近研究還發(fā)現(xiàn),原花青素具有降低甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇,升高高密度脂蛋白膽固醇,抑制動(dòng)脈粥樣硬化等有益于心血管疾病的作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察原花青素對(duì) ROS引起的H UVEC脂質(zhì)過氧化損傷的影響,揭示H2O2可作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的誘發(fā)物,導(dǎo)致VEC脂質(zhì)過氧化損傷,可抑制VEC3H-TdR摻入,減少DNA合成期細(xì)胞比例,并具有劑量依賴性;而原花青素可以對(duì)抗H2O2導(dǎo)致的VEC DNA合成減少及細(xì)胞增殖活性下降,具有一定的保護(hù)作用,并表現(xiàn)出劑量依賴性,這可能與原花青素對(duì)ROS有清除和抑制生成作用有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),原花青素有益心血管效應(yīng),對(duì)于PCI術(shù)后 RS的防治可能具有應(yīng)用前景,但其心血管治療作用的研究資料大部分是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),臨床試驗(yàn)資料相對(duì)較少,最終能否用于PCI術(shù)后 RS防治,尚待進(jìn)一步大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)。

[1]Pendyala L,Jabara R,Shinke T,et al.Drug-eluting stents:present and future[J].Cardiovasc Hematol Agents Med Chem,2008,6(2):105-115.

[2]Zhao FH,Chen YD,Jin ZN,et al.Are impaired endothelial progenitor cells involved in the processes of late in-stent thrombosis and re-endothelialization of drugeluting stents[J]?Med Hypotheses,2008,70(3):512-514.

[3]Berliner JA,Gharavi NM.Endothelial cell regulation by phospholipid oxidation products[J].Free Radic Biol Med,2008,45(2):119-123.

[4]Thomas SR,Witting PK,Drummond GR.Redox control of endothelial function and dysfunction:molecular mechanisms and therapeutic opportunities[J].Antioxid Redox Signal,2008,10(10):1713-1765.

[5]Del Bas JM,Ricketts ML,Baiges I,et al.Dietary procyanidins lower triglyceride levels signaling through the nuclear receptor small heterodimer partner[J].Mol Nutr Food Res,2008,52(10):1172-1181.

[6]Pataki T,Bak I,Kovacs P.Grape seed proanthocyanidins improved cardiac recovery during reperfusion after ischemia in isolated rat hearts[J].Am J Clin Nutr,2002,75(5):894-899.

[7]Iwaguro H,Asahara T.Endothelial progenitor cell culture and gene transfer[J].Methods Mol Med,2005,112:239-247.

[8]Farah R,Shurtz-Swirski R,Bolotin Y,et al.Oxidative stress and inflammation due to peripheral polymorphonuclear leukocytes after coronary angiography vs percutaneous coronary intervention[J].Minerva Cardioangiol,2008,56(2):189-195.

[9]Li HB,Yi X,Gao JM,et al.The mechanism of hyperoside protection of ECV-304 cells against tert-butyl hydroperoxide-induced injury[J].Pharmacology,2008,82(2):105-113.

[10]Gamkrelidze M,Mamamtavrishvili N,Bejitashvili N,et al.Role of oxidative stress in pathogenesis of atherosclerosis[J].Georgian Med News,2008,(163):54-57.

[11]Amom Z,Zakaria Z,M ohamed J,et al.Lipid lowering effect of antioxidant alpha-lipoic acid in experimental atherosclerosis[J].J Clin Biochem Nutr,2008,43(2):88-94.

[12]Bruckdorfer KR.Antioxidants and CVD[J].Proc Nutr Soc,2008,67(2):214-222.

[13]Kimura Y,Ito H,Kawaji M,et al.Characterization and antioxidative properties of oligomeric proanthocyanidin from prunes,dried fruit of Prunus domestica L[J].Biosci Biotechnol Biochem,2008,72(6):1615-1618.

[14]Lee KW,Kang NJ,Oak MH,et al.Cocoa procyanidins inhibit expression and activation of MMP-2 in vascular smooth muscle cells by direct inhibition of M EK and M T1-MMP activities[J].Cardiovasc Res,2008,79(1):34-41.