胰島素和丁酸鈉對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞組蛋白乙?；霸鲋诚嚓P(guān)基因和蛋白的影響

傅春江,何作云,王旭開△,楊成明,王紅勇,方玉強(qiáng),石偉彬,韓 愈,何多芬

(第三軍醫(yī)大學(xué):1.大坪醫(yī)院心內(nèi)科,重慶400042;2.新橋醫(yī)院心內(nèi)科,重慶400037)

我國(guó)人群高血壓(EH)的患病率呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì),大量研究證實(shí),高血壓合并糖尿病及高胰島素血癥的患者,發(fā)生心腦血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)大大高于單純高血壓患者。研究還證實(shí),胰島素可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中bFGF、TGF-β、PDGF、Matrix Gla和OPN等細(xì)胞增殖及表型相關(guān)基因及蛋白高表達(dá),而決定VSMC表型的a-SM卻是低表達(dá),表明胰島素促進(jìn)VSMC異常增殖的同時(shí)還伴有VSMC表型改變。那么VSMC是通過(guò)何種方式引起這些基因表達(dá)差異的呢?目前尚缺乏相關(guān)研究。既往對(duì)胰島素引起血管平滑肌細(xì)胞異常增殖的研究,多從細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(如AP-1等),應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及結(jié)構(gòu)基因本身改變等方面入手。近年來(lái),基因外修飾,特別是組蛋白修飾對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控有了重要的進(jìn)展,提出了“組蛋白密碼”的假說(shuō):即結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的開放與關(guān)閉與組蛋白修飾-染色質(zhì)重構(gòu)有關(guān)。胰島素可以促進(jìn)VSMC增殖,這種作用和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路密切相關(guān),在胰島素引起VSMC增殖的過(guò)程中,是否通過(guò)了組蛋白修飾,以及MAPK是否參與了這種修飾,目前還不清楚,這正是本研究所要探討的。

1 材料和方法

1.1 材料 自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)購(gòu)自北京阜外醫(yī)院;胎牛血清和DM EM購(gòu)自Gibco公司;PD98059購(gòu)自Promega公司;羊抗鼠抗體、羊抗兔抗體、兔抗羊抗體購(gòu)自Sigma公司;胰島素購(gòu)自德國(guó)Roche公司,抗MAPK抗體、抗α-SM actin抗體購(gòu)自Sigma公司;抗 HDAC1抗體、抗H3賴氨酸乙酰化抗體購(gòu)自Cellsignaling公司;抗 PDGF抗體、抗骨橋蛋白(OPN)抗體購(gòu)自Santa公司;β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 VSMC的分離培養(yǎng)及分組 采用純種4周齡雄性SHR,分離主動(dòng)脈,去除內(nèi)膜與外膜,用貼塊法分離培養(yǎng)VSMC,經(jīng)免疫組化鑒定,6～10代的VSMC用于研究。實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組。(1)空白對(duì)照組(C組):不加任何干預(yù);(2)胰島素組(insulin組):加入終濃度為10-7mol/L胰島素作用;(3)PD98059組:加入終濃度為 10-5mol/L PD98059;(4)丁酸鈉組(Na組):加入終濃度為10-3mol/L丁酸鈉;(5)胰島素聯(lián)合PD98059組(insulin聯(lián)合 PD98059組):PD98059預(yù)處理30min后,再加入同樣濃度的胰島素;(6)胰島素聯(lián)合丁酸鈉組(insulin聯(lián)合Na組):丁酸鈉預(yù)處理 30min后,再加入同樣濃度的胰島素。以上各組胰島素均作用24h。

1.2.2 VSM C蛋白質(zhì)提取 按1×108cells/L細(xì)胞數(shù)接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),貼壁生長(zhǎng)后換含1%小牛血清DMEM培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)24h。將靜置培養(yǎng)的VSMC細(xì)胞按組別分別加或不加PD98059、丁酸鈉,孵育30min后每孔加或不加胰島素;孵育24h后棄去培養(yǎng)基,冷PBS漂洗,0.25%胰酶消化,4 000r/min、2min,棄上清液,冷PBS漂洗,4 000r/min、2min,棄上清液。4℃下在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液(cell lysis buffer 100μ L+PMSF1μ L),4℃下1h充分裂解。取上清液分裝、保存。DU 800 Spectrophotometer建立蛋白質(zhì)濃度曲線后測(cè)定蛋白質(zhì)樣品濃度。

1.2.3 免疫印跡 提取的蛋白質(zhì)按100μ g上樣,9%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,125V,90min分離蛋白質(zhì)125V,125mA,1h轉(zhuǎn)印至PVDF膜。TBST漂洗3次,每次5min,TBS配置的5%脫脂奶粉封閉 2h。用抗 MAPK、α-SM actin和 OPN、HDAC1、PDGF、H3賴氨酸乙?；贵w進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 胰島素和丁酸鈉對(duì)MAPK的影響 經(jīng)胰島素刺激后,VSMC的MAPK表達(dá)明顯增加,這與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,而用丁酸鈉和PD98059預(yù)處理后,胰島素促進(jìn)MAPK的表達(dá)作用明顯減弱(P＜0.05),在未給予胰島素干預(yù)情況下,PD98059對(duì)VSM C M APK的表達(dá)亦有降低作用(P＜0.05)(圖1)。

圖1 胰島素和丁酸鈉對(duì)MAPK的影響

2.2 胰島素和丁酸鈉對(duì)HDAC1的影響 用胰島素作用于VSMC,結(jié)果顯示胰島素可上調(diào)HDAC1的表達(dá),說(shuō)明胰島素對(duì)組蛋白乙酰化/去乙?；a(chǎn)生了影響。這種作用可被丁酸鈉所阻斷,但PD98059對(duì)胰島素作用后的HDAC1無(wú)明顯影響,說(shuō)明胰島素促進(jìn)HDAC1表達(dá)并沒有通過(guò)MAPK途徑,而丁酸鈉組HDAC1的表達(dá)最低,提示丁酸鈉對(duì)生理情況下SHR VSMC HDAC1蛋白質(zhì)的表達(dá)即有抑制作用(圖2)。

2.3 胰島素和丁酸鈉對(duì)H3賴氨酸乙?；挠绊?經(jīng)胰島素作用后,SHR VSMC H3乙酰化賴氨酸(Lys9)的表達(dá)較正常對(duì)照組升高(P＜0.05),而 PD98059可使正常對(duì)照組 H3乙?；嚢彼岬谋磉_(dá)減弱,同時(shí)抑制胰島素對(duì)H3乙?；嚢彼岬纳险{(diào)作用,說(shuō)明胰島素促進(jìn)H3賴氨酸乙酰化的作用通過(guò)MAPK途徑。丁酸鈉可使SHR VSMC H3乙酰化賴氨酸的表達(dá)明顯升高,提示丁酸鈉可明顯促進(jìn)VSMC H3的乙?；?圖3)。

圖2 胰島素和丁酸鈉對(duì)HDAC1的影響

圖3 胰島素和丁酸鈉對(duì)H3乙酰化賴氨酸的影響

2.4 胰島素和丁酸鈉對(duì)PDGF的影響 免疫印跡結(jié)果顯示胰島素組PDGF的表達(dá)明顯高于其他組(P＜0.05),PD98059及丁酸鈉預(yù)處理后,與胰島素組比較這種作用受到明顯的抑制(P＜0.05)(圖4)。

圖4 胰島素和丁酸鈉對(duì)PDGF的影響

2.5 胰島素和丁酸鈉對(duì)α-SM actin的影響 免疫印跡結(jié)果顯示胰島素組α-SM actin的表達(dá)明顯低于其他組(P＜0.05),PD98059及丁酸鈉預(yù)處理后,這種作用受到明顯的抑制與胰島素組比較(P＜0.05)(圖 5)。

2.6 胰島素和丁酸鈉對(duì)OPN的影響 免疫印跡結(jié)果顯示胰島素作用后OPN的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.05),PD98059及丁酸鈉預(yù)處理后,OPN的表達(dá)明顯減弱,與胰島素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖 6)。

圖5 胰島素和丁酸鈉對(duì)α-SM actin的影響

圖6 胰島素和丁酸鈉對(duì)OPN的影響

3 討 論

丁酸鈉是HDAC抑制劑,通過(guò)抑制HDACs的活性,引起組蛋白超乙?；?。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)丁酸鈉對(duì)許多種細(xì)胞的異常增殖能夠起到抑制作用,并且丁酸鈉已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤的臨床研究。但是關(guān)于丁酸鈉對(duì)高胰島素血癥時(shí)VSMC的異常增殖作用研究得較少。本研究發(fā)現(xiàn),在丁酸鈉預(yù)處理后,胰島素促進(jìn)VSMC增殖的作用受到明顯抑制,說(shuō)明組蛋白的超乙酰化同樣對(duì)VSMC異常增殖具有抑制作用。在丁酸鈉處理后,結(jié)果顯示H3組蛋白賴氨酸乙?；c其他組相比明顯增強(qiáng),這和國(guó)外的相關(guān)研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn),在使用胰島素刺激后,H3組蛋白賴氨酸表達(dá)亦增強(qiáng),為什么都是組蛋白賴氨酸乙?；鰪?qiáng)而胰島素的作用表現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖,而丁酸鈉的作用是抑制細(xì)胞增殖呢?組蛋白乙?；梢灾泻徒M蛋白所帶正電荷,從而減弱核小體中堿性氨基酸與DNA的靜電吸引力,降低其與帶負(fù)電荷DNA鏈的親和性,降低相鄰核小體之間的聚集,使DNA與組蛋白空間位阻增大,兩者間的相互作用減弱,DNA易于解聚,染色質(zhì)呈轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu),因此有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA模板相結(jié)合,增加轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)入進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄[1]。本研究也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因PDGF在胰島素的作用下表達(dá)明顯升高,同時(shí)伴隨H3賴氨酸乙?；鰪?qiáng),說(shuō)明H3賴氨酸乙酰化使得PDGF基因活化。關(guān)于細(xì)胞增殖相關(guān)因子PDGF是目前研究得比較多的,大量的研究證實(shí)PDGF促進(jìn)VSMC的增殖,這種現(xiàn)象在腫瘤細(xì)胞也得到證實(shí),胰島素促進(jìn)VSMC增殖和很多癌基因的激活相關(guān),癌基因激活后又可通過(guò)增殖相關(guān)因子的激活從而使細(xì)胞增殖。因此,丁酸鈉可能對(duì)VSMC的增殖存在抑制作用。丁酸鈉抑制細(xì)胞增殖的原因在于其使組蛋白超乙酰化,有研究證實(shí)組蛋白乙酰化促進(jìn)細(xì)胞增殖,但組蛋白的超乙?；炊种萍?xì)胞增殖,研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可以下調(diào)增殖相關(guān)細(xì)胞核抗原(PCNA)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤敏感蛋白p130(pRb)、細(xì)胞分裂控制蛋白2同系物(cdc2),細(xì)胞周期素(cyclin)B1、細(xì)胞分裂控制蛋白 20同系物(p55cdc),HMG1、2以及其他細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá),上調(diào)cyclin D1、p21WAF1、p141NK4B/p15INK5B、叢集蛋白等增殖抑制基因的表達(dá)。同時(shí)丁酸鈉還對(duì)應(yīng)激相關(guān)蛋白如熱休克蛋白(HSP)、細(xì)胞色素P450,血管功能調(diào)節(jié)蛋白存在影響[2]。丁酸鈉還對(duì)GST-P1在核上的定位存在影響,同時(shí)下調(diào)應(yīng)激氧化蛋白[3],從而抑制VSMC的增殖。因此,丁酸鈉抑制細(xì)胞增殖和兩方面因素有關(guān):(1)組蛋白的超乙酰化抑制了增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄;(2)組蛋白的這種超乙?；龠M(jìn)抗癌基因及增殖抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性,且這種作用具有腫瘤相關(guān)基因特異性,其具體機(jī)制目前不清。使用丁酸鈉處理后,組蛋白的超乙?；瘜?duì)MAPK也起到抑制作用,MAPK作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在VSMC增殖過(guò)程中扮演著重要的角色[4],胰島素促進(jìn)VSMC增殖其中的重要一條通路就是MAPK途徑已經(jīng)得到較廣泛地認(rèn)同。

本研究發(fā)現(xiàn),丁酸鈉明顯抑制MAPK蛋白的表達(dá)。這可能是丁酸鈉抑制胰島素促VSMC增殖的一個(gè)重要機(jī)制。在本研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象,胰島素雖然促進(jìn)H3組蛋白乙酰化,但對(duì)HDAC1的作用卻是增強(qiáng)的。HDAC1是組蛋白去乙?；钢?可以使組蛋白去乙?；?從理論上講,HDAC1的增強(qiáng)應(yīng)該使組蛋白去乙?；鰪?qiáng),乙?；瘻p弱,但本研究的結(jié)果卻顯示胰島素促進(jìn)HDAC1的表達(dá)。作者分析這可能和兩方面因素有關(guān):(1)組蛋白的去乙酰化是HDAC家族共同作用的結(jié)果,每一種HDAC對(duì)結(jié)合在DNA上的組蛋白靶點(diǎn)是不同的,胰島素可能對(duì)不同的HDAC具有不同的作用;(2)胰島素促進(jìn)了H3組蛋白的乙?；?是否在VSMC內(nèi)存在著一種反饋平衡機(jī)制,使得HDAC1的活性反而增強(qiáng)呢?以上只是推測(cè),具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。在阻斷MAPK后并不能抑制胰島素促進(jìn)HDAC1的作用,說(shuō)明胰島素促進(jìn)HDAC1的表達(dá)沒有通過(guò)MAPK途徑。因?yàn)榧?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有很多種,如蛋白激酶A(PKA),蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇-3(羥基)激酶(PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)通路等。胰島素的這種作用有可能通過(guò)了其他途徑。

本研究還證實(shí),PD98059可以阻斷胰島素促進(jìn)H3的乙?；饔?說(shuō)明在VSMC中,胰島素對(duì)H3的乙?；饔檬峭ㄟ^(guò)了MAPK信號(hào)通路的。在H3乙?；瘻p弱的同時(shí)伴隨VSMC增殖的抑制,說(shuō)明H3乙?；瘜?duì)VSMC的增殖具有重要意義。H3乙?；黾拥耐瑫r(shí)細(xì)胞也發(fā)生了表型的轉(zhuǎn)化,在VSMC中α-SM actin作為收縮型的標(biāo)志,而OPN和基質(zhì)蛋白作為合成型的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)VSMC增殖的同時(shí)往往伴隨這些蛋白的變化,因此,一部分研究者也把α-SM actin和OPN含量的變化作為細(xì)胞增殖的一個(gè)指標(biāo)。VSMC的主要特點(diǎn)是在成熟的血管組織中并非是其終末分化狀態(tài),因此在某種條件下其表型可以被調(diào)節(jié)。VSMC去分化狀態(tài)和表型的改變被認(rèn)為是在動(dòng)脈粥樣硬化和新生內(nèi)膜過(guò)度增殖過(guò)程中血管壁重構(gòu)的重要方面。分化狀態(tài)的VSM C呈紡錘形,增殖和收縮能力均很低;而去分化狀態(tài)的VSMC呈菱形或上皮細(xì)胞樣,具有較高的增殖能力和遷移能力,其蛋白水解活性也增加,而細(xì)胞支架和收縮蛋白含量降低,并且對(duì)凋亡誘導(dǎo)刺激的敏感性增加[5]。

胰島素可促使PDGF上調(diào),PD98059和丁酸鈉均可阻斷胰島素對(duì)VSMC的這種作用,說(shuō)明組蛋白的超乙?；ㄟ^(guò)某種途徑抑制了PDGF的表達(dá),組蛋白的乙?；?去乙?；淖?cè)谝葝u素促VSMC增殖的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)胰島素促使α-SM actin下調(diào)的同時(shí)使OPN上調(diào),且這種作用能夠被PD98059和丁酸鈉阻斷,因此,一方面說(shuō)明胰島素的這種作用通過(guò)了MAPK通路,另一方面說(shuō)明結(jié)構(gòu)基因的外修飾即組蛋白的乙?；?去乙?；淖冇绊懥诉@些蛋白質(zhì)的表達(dá)。從機(jī)制上推測(cè),組蛋白的超乙?；种屏四承┰鲋臣氨硇娃D(zhuǎn)化相關(guān)基因,使得VSMC的增殖受到抑制,從而升高α-SM actin和下調(diào)OPN。據(jù)此,作者認(rèn)為,胰島素是否通過(guò)這樣一個(gè)途徑而引起VSMC增殖的呢?即胰島素→MAPK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)→組蛋白乙酰化改變→相關(guān)增殖基因(如PDGF)活化→細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化。但其中許多具體環(huán)節(jié)尚待進(jìn)一步研究。在臨床上,冠脈內(nèi)支架植入術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于冠心病的治療,在支架植入后,如何預(yù)防再狹窄是保持支架作用長(zhǎng)期穩(wěn)定性的關(guān)鍵,雷帕霉素細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)是雷帕霉素靶蛋白(mTOR),其通常情況下被Akt磷酸化。雷帕霉素可以抑制mTOR下游的活化,包括JNK活化以及誘導(dǎo)凋亡[6],從而抑制VSM C的增殖,達(dá)到防止再狹窄的目的。目前,雷帕霉素涂層支架已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療并被認(rèn)可,丁酸鈉作為人體內(nèi)生理存在的成分,是否可以作為預(yù)防再狹窄的藥物?值得進(jìn)一步研究。

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