P16INK4A、Ki-67和HPV DNA16/18在絕經(jīng)后婦女宮頸鱗狀上皮病變中表達的意義

胡俊波,孫 軍

(湖北省婦幼保健院病理科,武漢430070)

2008年底,我國60歲以上老年人口已達到1億5989萬人,占總人口的12%,表明已經(jīng)進入了老齡化社會,老年人的健康日益引起社會的廣泛關注。宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,和高危HPV感染密切相關[1-2]。老年宮頸癌預后差,病死率高,嚴重威脅老年婦女身心健康。陰道鏡活檢做病理檢查作為診斷宮頸病變的金標準,降低了宮頸癌的發(fā)病率。絕經(jīng)后婦女因雌激素水平降低常常導致宮頸上皮萎縮,細胞層次減少,部分區(qū)核深染,與高級別上皮內(nèi)瘤變易混淆,成為診斷的陷阱[3-5]。本研究對104例絕經(jīng)后患者宮頸組織進行總結,以期找出有效的診斷標準。

1 材料與方法

1.1 材料 取自湖北省婦幼保健院病理科2004年12月至2008年12月子宮頸活檢及手術切除標本的存檔蠟塊共104例。其中CINⅠ級43例、CIN Ⅱ～Ⅲ級19例、宮頸浸潤癌22例,20例萎縮的宮頸組織為對照組。腫瘤分型按WHO(2003)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類標準進行。本組104例患者年齡55～75歲,平均(58.37±4.82)歲。

1.2 方法 用原位雜交法(ISH)檢測 HPV DNA16/18;用免疫組化Envision法檢測P16INK4A、Ki-67抗原。地高辛標記的HPV 16/18原位雜交探針、放大系統(tǒng)檢測試劑盒(福州泰普公司產(chǎn)品),單克隆抗體P16INK4A及多克隆抗體 Ki-67均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。HPV檢測陽性對照用子宮頸癌陽性片加陽性探針,TBS液代替陽性探針作為陰性對照。Envision檢測用TBS代替一抗作為陰性對照,乳腺癌組織作陽性對照。

結果判斷:在高倍鏡下隨機選取3個視野,每個視野計數(shù)200個腫瘤細胞或鱗狀細胞。HPV原位雜交:以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。P16INK4A蛋白定位細胞核或細胞質內(nèi)出現(xiàn)有棕黃色顆粒。按其染色有無及強弱程度劃分為:陽性細胞數(shù)小于5%或無陽性細胞為陰性;6%～25%為弱陽性;26%～50%為陽性;大于50%為強陽性。Ki-67以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,僅基底層細胞有表達為(-);陽性細胞數(shù)1%～20%為(+);21%～50%為(++);大于50%為(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法 處理采用SAS 8.12軟件分析,計數(shù)資料比較使用χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HPV與宮頸病變的關系(表1) HPV16/18在宮頸鱗癌、CIN組中均有陽性表達,在萎縮對照組中無表達(圖1)。HPVl6/18型在宮頸鱗癌及CIN組中的表達水平與萎縮對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),并且隨著CIN組織學分級的增加呈升高趨勢,尤其在宮頸CINⅡ/Ⅲ級、鱗癌兩組中的表達最明顯(圖2)。本實驗宮頸病變中 HPV總檢出率為28.57%(24/84)。

2.2 P16INK4A、Ki-67與宮頸病變的關系 P16INK4A、Ki-67在宮頸鱗癌、CINⅢ/Ⅱ、Ⅰ組的陽性表達率與萎縮對照組比較差異差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著宮頸病變嚴重程度的增加,P16INK4A、Ki-67的陽性表達率呈增加趨勢,尤其在宮頸鱗癌和CIN中的陽性表達率明顯增高(表2)。P16INK4A在宮頸鱗癌、CINⅢ、CINⅡ組中,表達以胞核和胞漿強陽性為主(圖3);在CINⅠ組中僅為弱陽性表達。Ki-67在宮頸鱗癌和CINⅢ中以強陽性表達為主(圖4)。P16INK4A、Ki-67在萎縮對照組中呈陰性表達(圖5、6)。

表1 HPV DNA 16/18在不同程度宮頸病變中的表達

表2 P16INK4A、Ki-67在不同程度宮頸病變中的表達

圖1 萎縮性黏膜細胞核HPVl6/18不表達(-)ISH法

圖2 CINⅢ中,中、表層細胞核出現(xiàn)散在棕黃色顆粒的細胞為HPVl6/18(+)ISH法

2.3 HPV DNA 16/18感染與P16INK4A表達程度之間的比較見表3。在絕經(jīng)后婦女子宮頸萎縮病變中,HPV DNA 16/18感染與P16INK4A蛋白表達為陰性,隨著CIN組中HPV DNA 16/18陽性率愈高,P16INK4A蛋白表達的強度就愈強。

圖3 CINⅢ中,P16INK4A在細胞核及細胞漿中出現(xiàn)彌漫棕黃色顆粒(+)SP法

圖4 Ki-67全層細胞核表達呈棕黃色顆粒(+)SP法

圖5 萎縮性黏膜細胞漿及細胞核P16INK4A不表達(-)SP法

圖6 萎縮性黏膜基底及旁基底層細胞核Ki-67呈散在棕黃色顆粒(-)SP法

表3 HPV DNA 16/18的感染與P16INK4A的關系

3 討 論

HPV感染是宮頸癌及癌前病變形成的最重要的原因,特別是持續(xù)性高危型HPV l6/18感染,如HPVl6型可在差不多50%的宮頸高度上皮鱗狀上皮內(nèi)瘤變(HSIL)和鱗癌中發(fā)現(xiàn),HPV18型與15%的鱗癌有關。老年患者的HPV病毒負荷量是較高的,研究發(fā)現(xiàn),HPV感染在人群中呈U型或S型分布,第1個高峰在25～35歲,第 2個高峰在大于55歲年齡段[6-8]。大多數(shù)HR-HPV感染(大于 55歲)與 HSIL及鱗癌密切相關,其中HPV 16/18是最常見的病毒亞型。當HPV16/18感染宮頸時,可將 HPV DNA整合到宿主細胞基因組中,進而病毒DNA上的E6、E7癌基因表達蛋白能引起自身調節(jié)和宿主調節(jié)基因表達失調,從而影響正常細胞周期調控,導致宮頸上皮細胞發(fā)生惡變。本研究結果顯示:HPV 16/18 DNA在19例CINⅡ/Ⅲ級和 22例宮頸癌組織中的陽性表達率分別為47.3%、36.4%,與文獻[9]報道近似。子宮頸 CINⅡ/Ⅲ級和鱗癌組 HPV16/18DNA陽性表達率明顯高于萎縮組(P＜0.01),且高于CINⅠ級組,證實子宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生與高危型HPV 16/18感染密切相關。萎縮組表達陰性,表明HPVl6/18 DNA在易誤診為HSIL的萎縮病變時可作為有效的鑒別診斷工具。本研究結果還顯示,原位雜交技術是一種檢測HPV感染的特異性強、技術成熟的方法,特異性可能比基于液體的方法強,定位準確,陽性預測值高,可直接發(fā)現(xiàn)整合到宿主細胞內(nèi)的HPV核酸[2]。而免疫組化檢測HPV不敏感,檢出率低;美國Digene公司 HC2檢測 HPV是非特異性(部分陽性病例是正常人群,可能為一過性病毒感染)[10]。結果提示原位雜交可作為臨床HPV檢測有效手段。

HPV與細胞周期的變化有關,特別是高危險性的HPV,所以細胞周期生物標志物能夠起HPV感染的替代標志物的作用,而且可以用于促進宮頸前體病變的精確診斷。P16INK4A是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,在宮頸鱗狀上皮非腫瘤性病變中陽性率極低或全部陰性,而在CIN尤其在高級別CIN中陽性率極高,作為輔助的診斷標記物可以有效地區(qū)分出CIN病變[11-12]。本研究的結果顯示P16INK4A蛋白在老年患者正?；蛭s性宮頸鱗狀上皮中均為陰性表達,而在CIN病變中陽性率顯著增加,隨著CIN級別升高,其表達強度亦相應增加,在CINⅡ/Ⅲ級和鱗癌組陽性率達 100%,與 Qiao等[13]報道相一致。據(jù)此可使絕大部分CIN病變區(qū)分出來,并客觀準確的分級。隨著CIN組中HPV DNA 16/18陽性率愈高,P16INK4A蛋白表達的強度就愈強,表明P16INK4A蛋白具有高危HPV的強烈陽性預測值。本研究結果顯示Ki-67在萎縮性宮頸鱗狀上皮標本中局限于基底及旁基底層,數(shù)量較少且散在,為陰性;在低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中陽性表達可達中層而高級別病變則可達全層;隨著病變級別增加,陽性表達也相應增高,可有助于區(qū)分萎縮與HSIL。但炎性及修復性病變中Ki-67表達也高,需聯(lián)合作P16INK4A蛋白(表達陰性),將假陽性病變排除。

綜上所述,在絕經(jīng)后宮頸鱗狀上皮瘤變中免疫組化檢測P16INK4A蛋白和Ki-67抗原,原位雜交檢查高危型HPV感染,作為一種臨床病理有效輔助診斷工具,可明確地區(qū)分萎縮和CIN病變,并指導CIN分級,有較好的臨床應用價值。

[1] Chen S,O′Sullivan H,Tabrizi SN,et al.Prevalence and genotyping of HPV in cervical cancer among Australian women[J].Int JGynaecol Obstet,1999,67(3):163.

[2] Levert M,Clavel C,Graesslin O,et al.Human papillomavirus typing in routine cervical smears.Results from a series of 3778 patients[J].Gynecol Obstet Fertil,2000,28(10):722.

[3] Feng J,Al-Abbadi MA,Bandyopadhyay S,et al.Significance of high-risk human papillomavirus DNA-positive atypical squamous cells of undetermined significance pap smears in perimenopausal and postmenopausal women[J].Acta Cytol,2008,52(4):434.

[4] Johnston EI,Logani S.Cytologic diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance in perimenopausal and postmenopausal women.lessons learned from human Papillomavirus DNA testing[J].Cancer,2007,111(3):160.

[5] Vetrano G,Aleandri V,Ciolli P,et al.Conservative approach to preneoplastic cervical lesions in postmenopause[J].Anticancer Res,2008,28(6B):3941.

[6] Syrj?nen K,Kulmala SM,Shabalova I,et al.Epidemiological,clinical and viral determinants of the increased prevalence of high-risk human papillomavirus(HPV)infections in elderly women[J].Eur JGynaecol Oncol,2008,29(2):114.

[7] Eltoum IA,Chhieng DC,Roberson J,et al.Reflex human papilloma virus infection testing detects the same proportion of cervical intraepithelial neoplasia grade 2-3 in young versus elderly women[J].Cancer,2005,105(4):194.

[8] Kutza J,Smith E,Levy B,et al.Use of hormone replacement therapy(Hrt)And detection of human papillomavirus(Hpv)Dna in postmenopausal women[J].Ann Epidemiol,2000,10(7):465.

[9] Smith EM,Johnson SR,Ritchie JM,et al.Persistent HPV infection in postmenopausal age women[J].Int JGynaecol Obstet,2004,87(2).131.

[10]李軍果,李力,郭建新,等.375例宮頸病變患者高危型人乳頭瘤病毒感染的研究[J].重慶醫(yī)學,2008,37(9):935.

[11]Bolanca IK,Ciglar S.Evaluation of P16INK4Ain cervical lesion of premenopausal and postmenopausal women[J].Coll Antropol,2007,31(Suppl 2):107.

[12]Engelsen IB,Stefansson I,Akslen LA,et al.Pathologic expression of p53 or p16 in preoperative curettage specimens identifies high-risk endometrial carcinomas[J].Am JObstet Gynecol,2006,195(4):979.

[13]Qiao X,Bhuiya TA,Spitzer M.Differentiating high-grade cervical intraepithelial lesion from atrophy in postmenopausal women using Ki-67,cyclin E,and p16 immunohistochemical analysis[J].J Low Genit Tract Dis,2005,9(2):100.