七葉皂甙鈉對腦出血大鼠血腫周圍TNF-α及Bcl-2表達的影響

鄭獻召 婁季宇 郭宗艷

1)河南焦作市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 焦作 454150 2)鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

本實驗通過觀察七葉皂甙鈉對腦出血大鼠血腫周圍組織TNF-α及Bcl-2,探討三七總皂甙對腦出血患者的作用價值,為研究三七總皂甙對腦出血后神經(jīng)細胞的保護作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 成年雄性Wister大鼠24只,體質(zhì)量200～250 g,由鄭州大學實驗動物中心提供,以標準飼料喂養(yǎng)。按照隨機化的原則將實驗動物分為2組,即治療組和模型組。每組均設(shè) 3 d、7 d 2個時間點,每個時間點設(shè) 6只大鼠。七葉皂甙鈉治療組于手術(shù)后6 h用七葉皂甙鈉腹腔注射1次,劑量為3mg/kg體質(zhì)量,以后1次/d。

1.2 主要儀器及試劑 江灣Ⅱ型立體定位儀,微量進樣器(上海醫(yī)用儀器廠),顯微外科手術(shù)器械,牙科鉆,TNF-α多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),Bcl-2單克隆抗體(Santa cruz公司產(chǎn)品),SP系列二抗(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

1.3 大鼠尾狀核腦出血模型建立及給藥 利用自體動脈血緩慢注射法建立腦出血動物模型。參照Xue等[1]的方法,大鼠用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上,碘伏消毒局部皮膚,行頂部正中切口,調(diào)整立體定位儀使大鼠前囟和后囟在同一平面,以前囟中央為原點,于前囟前0.2 mm,中線向右旁開3.5 mm處鉆一直徑為1 mm的小孔,微量進樣器沿鉆孔進針,深度為5 mm,即尾狀核位置,ICH組及治療組大鼠被緩慢注入50 Ul自體動脈血,動脈血采自股動脈;假手術(shù)組注入50 Ul滅菌生理鹽水,15～20min注射完畢,留針5min后緩慢將針退出,縫合皮膚。

1.4 標本及病理切片的制作 各組大鼠在相應的時間點用過量的水合氯醛麻醉,迅速打開胸腔,由左心室灌注生理鹽水,直至由剪開的右心耳流出的液體變?yōu)榍辶翞橹?然后斷頭取腦,腦組織標本浸于10%福爾馬林液中固定72 h,以針眼為中心取厚約1 cm的冠狀切片,石蠟包埋,然后在切片機上連續(xù)切片,片厚2 um,分別行 TNF-α及Bcl-2免疫組化染色。

1.5 圖像采集分析 光學顯微鏡下,DAB染色陽性細胞呈棕黃色或褐色,利用德國Leicai分析系統(tǒng)對圖像進行分析,每張圖像選取5個不同的視野,得平均灰度值和平均積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示,采用SPSS12.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,各指標組間比較用方差分析進行檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

模型組的腦血腫周圍組織均有TNF-α及Bcl-2的表達,并且隨時間延長,TNF-α表達增加,而Bcl-2的表達減弱。治療組血腫周圍組織也有TNF-α及Bcl-2的表達,但各時間點的差異不大且表達水平很低。TNF-α及Bcl-2在2組之間的平均積分光密度值比較結(jié)果具有統(tǒng)計學意義,P＜0.05。見表1,2。

表1 腦血腫周圍 TNF-α的表達情況及其陽性區(qū)平均積分光密度值

表2 腦血腫周圍Bcl-2的表達情況及其陽性區(qū)平均積分光密度值

3 討論

腦出血后存在明顯炎性反應,炎性反應程度與血腫周圍腦組織水腫及繼發(fā)性腦組織損害密切相關(guān)。Cong等[2]研究表明,腦出血后血腫周圍有較多的白細胞和巨噬細胞浸潤,活化的白細胞和巨噬細胞釋放一些細胞毒性介質(zhì),從而加重腦出血的繼發(fā)性損傷。

TNF-α是一種主要由激活的單核/巨噬細胞分泌的炎性細胞因子。臨床研究表明,腦出血患者早期血漿TNF-α含量升高,并持續(xù)一定時間。實驗研究證實[3],腦出血后血腫周圍腦組織TNF-α表達明顯增強。研究表明 TNF-α具有促使白細胞聚集、黏附、浸潤,引發(fā)炎癥反應的作用,造成腦損傷。據(jù)報道,通過抑制TNF-α的表達能夠促進凋亡抑制基因Bcl-2的表達,抑制受損細胞的凋亡程度[4]。

本實驗利用Xue等的方法建立大鼠腦出血模型,將大鼠隨機分為治療組和模型組,在各時間點處死大鼠后取腦組織制作切片,并對標本進行免疫組化染色,以檢測TNF-α及Bcl-2在腦血腫周圍的表達情況。結(jié)果顯示七葉皂甙鈉治療組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α的表達水平低于模型組,而Bcl-2的表達水平高于模型組。研究認為Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用[5],TNF-α則與細胞的凋亡有關(guān)[6],而Bcl-2則對腦損傷有保護性作用。從實驗結(jié)果可以看出治療組大鼠血腫周圍組織Bcl-2的表達水平均高于模型組,而TNF-α表達降低。這可能與Bcl-七葉皂甙鈉的治療作用有關(guān)。

七葉皂甙鈉系婆羅子植物提取的藥物,主要成分為三萜皂甙,具有抗炎、抗?jié)B出,消腫脹,增加靜脈張力,改善微循環(huán)的作用。近年臨床上應用β-七葉皂甙鈉治療急性腦出血病人獲得明顯效果[7]。該研究觀察了七葉皂甙鈉對腦出血大鼠血腫周圍TNF-α及Bcl-2表達的影響,研究結(jié)果表明七葉皂甙鈉可以抑制腦出血炎癥因子的表達,減輕腦損傷的程度。

[1]Xue Mengzhou,Mare R,Del Bigio.Intracerebral injection of autologous whole blood in rats,time course of inflammation and death[J].Neuroscience Letters,2002,283:230-235.

[2]Cong C,Hoff JT,Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat[J].Brain Res,2000,871(1-2):57-65.

[3]M ayne M,Ni W,Yan HJ,et al.Antisense oligodeoxy nucleotide inhibition of tumor necrosis facto r-αexpression is neuroprotective after intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2001;32(3):240-8.

[4]M erry DE,Ko rsmeyer SJ.Bcl-2 gene family in the nerous system[J].Anna Reve Neurosci 1997,20:245-267.

[5]GongC,BoulisN,QianJ,et al.Intracerebral hemorrhage-inducedneuronal death[J].Neurosurgey,2001,48(4):875-882.

[6]章春園,溫仲民,包仕堯.β-七葉皂甙鈉治療急性腦出血 123例療效觀察[J].蘇州大學學報(醫(yī)學版),2003,23(3):346-347.

[7]成廣芝.β-七葉皂甙鈉與甘露醇聯(lián)合治療腦出血臨床觀察[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2001,9(3):179-180.