黃芪甲苷對腦缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用及occludin蛋白表達(dá)的影響

曲友直 趙燕玲 李 敏 高國棟

血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)的破壞可導(dǎo)致血管源性腦水腫,是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎(chǔ)[1,2]。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是BBB結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)[3],咬合蛋白Occludin是內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接的重要結(jié)構(gòu)蛋白,其水平的高低與BBB的開放、關(guān)閉關(guān)系密切。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分,常作為黃芪及含黃芪(君藥)的中成藥定性定量評價(jià)的指標(biāo)[4,5]。已有研究表明黃芪甲苷具有減少腦缺血再灌注后腦組織白細(xì)胞浸潤、抗炎性反應(yīng)、減輕腦水腫等作用,但目前作用機(jī)制尚不明確。本研究通過觀察黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量、伊文氏藍(lán)(Evans Blue,EB)含量及咬合蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的影響,以探討其對BBB的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪甲苷(中國藥品生物制品檢定所,批號：110781-200613)。伊文氏藍(lán)購自美國Sigma公司。Occludin蛋白免疫組化試劑盒購自美國Zymed公司。醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),型號 Olym pus BX-51。健康成年雄性SD大鼠,體重250～300 g,購自本校實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 檢測方法 72只SD大鼠隨機(jī)等分為4組,每組18只。A組為假手術(shù)組,栓線僅插入頸總動脈6 mm,不阻塞大腦中動脈,其余步驟同B組;B組為生理鹽水對照組,參照Zea Longa報(bào)道的方法[6],采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。結(jié)扎大鼠頸總和頸外動脈,自頸總動脈分叉處向頸內(nèi)動脈插入栓線約(18.5±0.5)mm,阻斷大腦中動脈血流,造成局灶性腦缺血,大腦中動脈閉塞即刻經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水;術(shù)后將栓線尾部置于皮下,缺血1.5 h后輕拔栓線造成血流再灌注24 h;C組為小劑量黃芪甲苷治療組,大腦中動脈閉塞即刻經(jīng)腹腔注射黃芪甲苷10 mg/kg;D組為大劑量黃芪甲苷治療組,大腦中動脈閉塞即刻經(jīng)腹腔注射黃芪甲苷20 mg/kg。再灌注24 h后每組隨機(jī)取6只大鼠斷頭取腦稱濕重,放入烤箱內(nèi)干燥24 h后稱干。腦組織含水量按以下公式級算：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重。每組中另外6只大鼠于處死前1 h經(jīng)股靜脈緩慢注入2.5%伊文氏藍(lán)生理鹽水0.2 m l/100 g。再灌注24 h時(shí)開胸經(jīng)左心室灌注生理鹽水,斷頭取腦稱重后放入甲酰胺中浸泡,收集浸泡的甲酰胺溶液,用分光光度計(jì)(620～680 nm)測得其吸光度,計(jì)算腦組織中EB含量。每組其余6只大鼠,在術(shù)后相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)水合氯醛深度麻醉后,自左心室灌注生理鹽水200 m l沖凈血液,500 m l4%多聚甲醛溶液固定大鼠各組織,斷頭取腦;將標(biāo)本在4%多聚甲醛溶液中后固定24 h;鼠腦自額極至枕葉分為A、B、C、D、E 5等份,取 C 腦片在恒溫冰凍切片機(jī)上做厚度為15μm的冠狀面位切片,進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化染色用圖像分析系統(tǒng)采集照片,在400倍視野下每張切片在梗死灶周圍隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)免疫組化陽性血管。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件包。各組實(shí)驗(yàn)值均以±s來表示,組間差異采用方差分析,同組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

與A組相比,B組大鼠腦組織含水量、伊文氏藍(lán)含量明顯增多,occludin蛋白免疫組化陽性血管的數(shù)目顯著減少(P＜0.01);與B組相比,C組和D組大鼠腦組織含水量、伊文氏藍(lán)含量顯著減少,occludin蛋白免疫組化陽性血管的數(shù)目顯著增加(P＜0.05)。C組和D組比較,腦組織含水量、伊文氏藍(lán)含量及occludin蛋白免疫組化陽性血管的數(shù)目無顯著差異(P＞0.05)(表1)

表1 黃芪甲苷對大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量、伊文氏藍(lán)含量及occludin蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

腦水腫是腦缺血再灌注損傷的基本病理變化之一,也是導(dǎo)致病情加重、甚至引起患者死亡的常見病因。血腦屏障的破壞可導(dǎo)致血管源性腦水腫,是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎(chǔ)[1,2]。細(xì)胞間緊密連接是一組復(fù)雜蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體。咬合蛋白(occludin)是細(xì)胞間緊密連接復(fù)合體的重要結(jié)構(gòu)蛋白。咬合蛋白作為一種跨膜蛋白,其氨基端和羥基端位于細(xì)胞內(nèi),兩個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)位于細(xì)胞外,這兩個(gè)向細(xì)胞外伸出的環(huán)形結(jié)構(gòu)與臨近細(xì)胞膜上occludin伸出的環(huán)形結(jié)構(gòu)緊密相連,進(jìn)而封閉彼此間細(xì)胞間隙。其胞內(nèi)的氨基端和羥基端與膜相關(guān)鳥苷激酶樣閉鎖小帶蛋白(zonula occludens protein,ZO-1)緊密連接,再通過ZO-1與細(xì)胞骨架連接在一起,在細(xì)胞膜上得到固定并保持其連續(xù)性[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大、小劑量黃芪甲苷均可降低腦缺血再灌注后腦組織含水量及伊文氏藍(lán)含量。正常情況下伊文氏藍(lán)進(jìn)入體內(nèi)后與血清白蛋白結(jié)合不能通過BBB,腦缺血再灌注后由于BBB破壞、通透性增加。伊文氏藍(lán)會通過血管壁進(jìn)入腦組織,因此伊文氏藍(lán)可作為示蹤劑對BBB破壞進(jìn)行定量評價(jià)[8]。本研究結(jié)果顯示,大鼠腦缺血再灌注模型建立后腦內(nèi)含水量及伊文氏藍(lán)含量顯著增加,表明在缺血再灌注損傷中血腦屏障結(jié)構(gòu)遭到破壞,通透性顯著提高;使用黃芪甲苷治療后腦組織內(nèi)含水量以及伊文氏藍(lán)含量明顯降低,提示黃芪甲苷能夠減輕缺血、缺氧造成的BBB通透性改變,減少蛋白漏出,一定程度上降低了腦細(xì)胞的水腫程度,遏制腦缺血病程的發(fā)展,從而發(fā)揮對腦缺血的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,大、小劑量黃芪甲苷均可上調(diào)腦缺血再灌注后occludin蛋白的表達(dá)水平。腦缺血再灌注后毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin表達(dá)顯著降低,使內(nèi)皮細(xì)胞間不能形成緊密連接復(fù)合體,進(jìn)而導(dǎo)致BBB緊密連接的破壞和血管源性腦水腫的產(chǎn)生[9]。應(yīng)用黃芪甲苷治療后表達(dá)降低的occludin顯著上調(diào),提示黃芪甲苷可通過減少腦缺血再灌注后occludin蛋白的損失,維持緊密連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的完整性,進(jìn)而起到了保護(hù)血腦屏障的作用,這可能是黃芪甲苷發(fā)揮對腦缺血再灌注后血腦屏障保護(hù)作用的機(jī)制之一。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),大劑量黃芪甲苷治療組與小劑量黃芪甲苷治療組相比較,缺血再灌注后腦組織含水量、伊文氏藍(lán)含量及occludin蛋白的表達(dá)無顯著差異,說明黃芪甲苷對BBB的保護(hù)作用在一定范圍內(nèi)與劑量大小無明顯關(guān)系,機(jī)制尚不清楚,本研究推測這可能與腦缺血再灌注 后血腦屏障破壞與多因素調(diào)控有關(guān)。

1 Nordal RA,W ong CS.Molecular targets in radiation-induced blood-brain barrier disruption.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,62(1)：279-287.

2 Begley DJ,Brightman MW.Stru ctural and function aspects of the blood-brain barrier.Prog Drug Res,2003,61(1)：39-78.

3 Ge S,Song L,Rachter JS.Where is the blood-brain barrier really?JNeurosci Res,2005,79(4)：421-427.

4 胡芳弟,封士蘭,趙鍵雄,等.HPLC法測定黃芪中黃酮類成分和黃芪甲苷的含量.分析測試技術(shù)與儀器,2003,9(3)：175-177.

5 秦海林,趙天增,高令潔,等.人參皂苷與黃芪甲苷的薄層色譜分析.中國中藥雜志,1995,20(4)：226-227.

6 Longa EZ,W einstein PR,Carlson S,et al.Reversib le m iddle cereb ral artery occ lusion w ithou t caniectomy in rats.Stroke,1989,20(1)：84-91.

7 Matter K,Balda MS.Functional analy sis of tight junctions.Methods,2003,30(3)：228-234.

8 Ikede Y,W ang M,Nakazaw a S.Sim ple quantitative evaluation of blood brain barrier disrup tion in vasogenic b rain edema.Acta Neu rochir,1994,60(suppl)：119-120.

9 Mark KS,Davis TP.Cereb ralm icrovascular changes in permeability and tight junctions induced by hypoxia-reoxygenation.Am JPhysiol H eart Cire Physiol,2002,282(6)：H 1485-H 1494.