當歸拈痛湯及其拆方對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織VEGF表達的影響*

廖江銓，田佳星，陳俊綿，王 浩，袁立霞

(南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東廣州 510515)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一種病因未明、以關(guān)節(jié)炎癥為主的慢性反復(fù)發(fā)作的全身性疾病。血管內(nèi)皮生長因子又稱為血管通透因子(vascular permeabiityfac tor，VEGF)，是一種細胞來源廣泛的多功能性糖蛋白，它具有強大的促血管增生和增強血管通透性的功能。VEGF在RA的滑膜血管翳的形成過程中起關(guān)鍵作用，是聯(lián)系各種炎性因子的樞紐，直接促進滑膜組織新生血管形成，并增強血管的通透性。當歸拈痛湯是臨床治療RA行之有效的方劑，筆者采用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎模型，觀察當歸拈痛湯及拆方對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織VEGF蛋白表達的影響，探討當歸拈痛湯部分作用機制，為尋找新的臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

當歸拈痛湯:羌活、茵陳、炙甘草各15g，豬苓、澤瀉、防風、知母、蒼術(shù)、當歸各9g，葛根、苦參、人參各6g，升麻、黃芩、白術(shù)各3g。

拆方1組(蠲痹組):羌活、茵陳各15g，豬苓、澤瀉、防風、知母、蒼術(shù)各9g，葛根、苦參各6g，升麻、黃芩各3g。拆方2組(扶正組):白術(shù)3g，人參6g，當歸9g，炙甘草15g。

1.2 試劑

弗氏完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品;雷公藤多甙片為上海醫(yī)科大學紅旗制藥廠生產(chǎn)，國藥準字z31020415;VEGF免疫組化試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.3 動物

健康Wistar雄性大鼠60只，體重180g±20g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，室溫18℃ ±2℃，相對濕度45% ～50%，空氣新鮮，通風良好，自由攝食、飲水。

2 方法

2.1 大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的模型制備

臨用前從冰箱取出弗氏完全佐劑(CFA)，充分振蕩、混勻。大鼠常規(guī)消毒后將其右后肢拉直，用1ml注射器針頭于足跖中部皮內(nèi)注射，每只大鼠注射0.1ml CFA。

2.2 分組方法

將Wistar雄性大鼠60只按體重大小隨機分為6組，每組10只，設(shè)為空白對照組、模型組、雷公藤組、當歸拈痛湯組、拆方1組、拆方2組?？瞻讓φ战M不做任何處理。模型組、雷公藤組、當歸拈痛湯組、拆方1組、拆方2組大鼠按 0.1ml/只給予弗氏完全佐劑注射于大鼠右后足墊內(nèi)。

2.3 給藥方法

實驗第8天每天早8∶00灌胃給藥，每日1次，全方組每日灌服當歸拈痛湯11.34g/kg，拆方1組每日灌服8.37g/kg，拆方2組每日灌服2.97g/kg，陽性藥對照組給予雷公藤多甙片混懸液9.45mg/kg灌服，空白組、模型組以1ml/100g蒸餾水給大鼠灌胃。連續(xù)灌胃給藥21d，于末次給藥2h后對大鼠進行相應(yīng)處理。

2.4 滑膜組織血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達檢測

滑膜取材方法:大鼠處死后，將大鼠仰位固定，酒精消毒，無菌處理，沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約3×3cm2的區(qū)域，以齒鑷提起髕骨。沿髕骨上沿約0.3×0.4cm2處向下切割直至股骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨，此時即打開了膝關(guān)節(jié)腔，可見由髕骨下極向上延續(xù)有1層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織。完整剝離滑膜組織，用刀片完整切下。將大鼠滑膜組織，放入4%多聚甲醛(內(nèi)含1/1000DEPC水)中固定2h，將已固定的標本取出，經(jīng)梯度酒精脫水，即70%A→80%A→95%A→100%A×3逐級脫水，二甲苯透明，然后石蠟包埋供VEGF免疫組化。免疫組化方法(S-P法)具體步驟按試劑盒操作。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測VEGF在AA大鼠滑膜組織中蛋白的表達，并觀察了當歸拈痛湯及其各拆方組對其的影響，其結(jié)果如下。

表1 各組AA大鼠滑膜VEGF表達的比較(s)

表1 各組AA大鼠滑膜VEGF表達的比較(s)

注:與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01;與全方組比較:*P<0.05

組別 例數(shù)(n)VEGF(%)空 白 組 10 8.79±1.33△△模 型 組 9 15.24±4.25雷 公 藤 組 9 10.98±2.80△△全 方 組 10 9.34±2.08△△拆 方 1 組 10 11.56±2.81△*拆 方 2 組 10 12.18±2.97△*

結(jié)果顯示，空白組大鼠滑膜組織血管周圍中僅見少量的VEGF陽性細胞，模型組大鼠滑膜血管周圍可見大量VEGF陽性細胞，滑膜組織中VEGF陽性表達較空白組有顯著增多，2組相比差異顯著(P<0.01);當歸拈痛湯、雷公藤組可見少量的VEGF陽性細胞，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01);兩拆方組滑膜組織VEGF陽性細胞呈現(xiàn)中量的陽性表達，與模型組有顯著性差異(P<0.05)，與全方組比較有顯著性差異(P<0.05)，二者比較無差異。說明當歸拈痛湯全方組、雷公藤組、拆方1組、拆方2組均能降低優(yōu)于滑膜組織中VEGF的表達，其中全方組作用最強，兩拆方組療效相當，具有協(xié)同作用，配伍應(yīng)用后療效明顯提高。

4 討論

VEGF與RA形成機制的研究最早是Fava在1994年提出的，F(xiàn)ava將RA的滑膜組織進行切片和VEGF免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，在滑膜的襯里層細胞中檢測到數(shù)目較多的VEGF陽性細胞，與其對照的骨關(guān)節(jié)炎(OA)組滑膜全部為陰性結(jié)果，推斷VEGF是RA關(guān)節(jié)滑膜病變有別于OA的一個重要特征，在RA滑膜血管新生中起關(guān)鍵作用。近期研究證明，RA關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期滑膜有較高水平的VEGF表達，VEGF的表達水平與AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分具有明顯的相關(guān)性。因此，VEGF可能是RA早期發(fā)病過程中的一個重要信號分子，它通過促進血管增生，增加血管通透性，加速滑膜血管翳的生成;另外，它可能與其他炎癥細胞因子形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，共同促進慢性炎癥的形成和發(fā)展。

本實驗研究表明，造模后AA模型大鼠組織病理形態(tài)學觀察到AA模型大鼠滑膜組織表現(xiàn)為滑膜增厚、血管增生和血管翳形成。免疫組化顯示，VEGF表達亦明顯增高，呈強陽性表達，提示RA早期就有新生血管的形成，VEGF表達與血管生成密切相關(guān)。進一步研究證實，VEGF參與了RA滑膜組織血管翳形成和發(fā)展過程。通過當歸拈痛湯全方組、拆方1組、拆方2組、雷公藤組藥物進行干預(yù)后，各組大鼠VEGF的表達量與模型組大鼠比較有不同程度減少，提示當歸拈痛湯組、拆方1組、拆方2組、雷公藤組均具有下調(diào)VEGF表達的作用。其中當歸拈痛湯全方組、雷公藤組療效最佳，兩拆方組療效相當。為此，推測當歸拈痛湯治療RA的機制可能是通過以下途徑實現(xiàn)的:①本方選用羌活、茵陳、黃芩、蒼術(shù)、白術(shù)、人參等蠲痹扶正中藥具有調(diào)節(jié)免疫、阻斷炎性細胞因子、阻斷關(guān)節(jié)炎的繼續(xù)發(fā)展;②RA滑膜血管翳是一種缺氧的高代謝組織，當歸拈痛湯中的當歸可活血化瘀，加速局部的血液循環(huán)，提高局部組織的氧供，抑制缺氧刺激的VEGF上調(diào)，降低關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，防止血管翳形成和骨質(zhì)破壞。綜上所述，VEGF參與了RA病理的形成和發(fā)展，而當歸拈痛湯可能通過抑制VEGF表達而阻斷滑膜炎癥、血管新生和血管翳形成。