湖南稻瘟病菌小種組成及湘資3150抗譜測(cè)定

黃紅梅，張 丹，劉二明

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）[1]引起稻瘟病是危害世界各國(guó)水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一。實(shí)踐證明，培育和利用抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法[2]。由于稻瘟病菌生理小種組成復(fù)雜，致病性變異頻繁，故一些抗病品種在大面積推廣種植3～5 a后就變?yōu)楦胁∑贩N[3]。因此，不斷發(fā)掘新的抗性資源、鑒定新的抗稻瘟病基因，尤其是從地方品種中發(fā)掘具有持久抗性的資源、鑒定和克隆持久抗性基因?qū)λ究沟疚敛∮N具有十分重要的意義。

秈稻湘資3150是湖南地方品種，是從38 000份國(guó)內(nèi)外栽培品種、野生稻等資源中，經(jīng)全國(guó)稻瘟病病圃抗性鑒定及原產(chǎn)地考證，優(yōu)選而來(lái)的材料。1990～1994年，該品種分別在6個(gè)不同緯度的病圃同步進(jìn)行抗性鑒定。22 a、68個(gè)病圃抗性試驗(yàn)的結(jié)果表明，湘資3150的平均發(fā)病級(jí)數(shù)為1.245，在吉、浙、湘、閩、粵、瓊等地的抗菌頻率均在94%以上[3]。這表明湘資3150具有抗、中抗稻瘟病，抗譜廣，抗性穩(wěn)定、持久等特點(diǎn)，是良好的抗源品種。同時(shí)篩選的持久抗瘟水稻品種還有小粒野生稻、天津野生稻、魔王谷、大白谷、Tetep等[3]，上述這些具有持久多抗性抗源的發(fā)現(xiàn)，在國(guó)內(nèi)外均系首次。

為了探明湖南省稻瘟病菌生理小種組成及其區(qū)域分布和消長(zhǎng)規(guī)律，筆者利用我國(guó)統(tǒng)一的7個(gè)稻瘟病菌鑒別品種對(duì)采自湖南省瀏陽(yáng)、桃江、煙溪等17個(gè)縣市的303個(gè)稻瘟病菌有效單孢菌株進(jìn)行生理小種鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試水稻材料 湘資3150（D1），秈稻，屬于湖南省地方品種；CO39，秈稻；全國(guó)統(tǒng)一的7個(gè)鑒別品種，即特特普（Z1）、珍龍 13（Z2）、四豐 43（Z3）、東農(nóng)363（Z4）、關(guān)東 51（Z5）、合江 18（Z6）、麗江新團(tuán)黑谷（Z7），均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物疾病控制研究所提供。

1.1.2 供試稻瘟病菌 供試的稻瘟病菌株共303個(gè)，均由采集的病樣經(jīng)單孢分離獲得。

1.2 鑒定方法

1.2.1 菌株分離與篩選 將收集自湖南省瀏陽(yáng)、桃江、煙溪等17個(gè)縣市的稻瘟病穗頸瘟標(biāo)樣，在整理、編號(hào)后，于低溫干燥狀態(tài)下儲(chǔ)藏備用。采用林代福[2]的眉毛針尖法進(jìn)行單孢分離。分離的單孢菌株在28℃恒溫箱中培養(yǎng)，反復(fù)純化，直到長(zhǎng)出的菌絲沒(méi)有雜菌為止，然后放入4℃冰箱中存儲(chǔ)備用。

1.2.2 菌株產(chǎn)孢、接種與鑒定 （1）稻瘟病菌的孢子培養(yǎng)。將已純培養(yǎng)的供試菌株接種到酵母淀粉斜面培養(yǎng)基上，待菌絲長(zhǎng)滿后，加入1.5 mL的滅菌水并輕刮菌絲，移取菌絲液到盛有燕麥片培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（15 cm）上，涂布均勻后放置在28℃恒溫箱中培養(yǎng)。待平板上菌絲長(zhǎng)滿后（約7 d），在無(wú)菌條件下刮除平板上的菌絲，置于室內(nèi)組織培養(yǎng)架上進(jìn)行24 h光照培養(yǎng)，室溫25～28℃。等到充分產(chǎn)孢（約3～4 d）后，每皿用含有0.02%Tween20的20 mL蒸餾水洗下孢子，顯微鏡下計(jì)數(shù)孢子數(shù)量50～100個(gè)孢子/視野（物鏡 10×）。（2）播種與育苗。供試的水稻材料預(yù)先在室溫下浸種，露白后播種于塑料育秧盤中（30 cm×25 cm×5 cm），每品種15粒（8品種/行×3行），每行按 Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、D1的順序播種，以麗江新團(tuán)黑谷（LTH）和CO39作為感病對(duì)照，每處理設(shè)置兩個(gè)重復(fù)。育苗土為預(yù)先經(jīng)過(guò)酸化處理，并添加了草炭、N、P、K肥和殺菌劑敵克松的田間土壤或草炭蛙石（2∶1）混合的基質(zhì)。冬春季育苗在溫室內(nèi)進(jìn)行，夏秋季在田間進(jìn)行。當(dāng)?shù)久玳L(zhǎng)到二葉期時(shí)，澆施（NH4）2SO41次（2 g/盤），促使秧苗嫩綠、健壯。（3）接種與調(diào)查。在水稻苗長(zhǎng)至3葉一心期時(shí)，將其移至保濕箱（50 cm×40 cm×35 cm）內(nèi)，用與空氣壓縮機(jī)連接的噴槍將孢子懸浮液均勻噴霧接種至秧苗上,并將保濕箱放入溫度26～28℃、控濕的組培室內(nèi)，黑暗保濕24 h，然后按正常光照周期進(jìn)行培養(yǎng)，并注意保濕和控溫，確保病斑的的正常擴(kuò)展。接種后7 d調(diào)查發(fā)病情況，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參考國(guó)際水稻所[3]報(bào)道的方法。（4）小種劃分。按照全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)劃分[4]。（5）水稻品種湘資3150的抗譜分析。抗譜 RS（Resistance Spectrum）（%）={表現(xiàn)R反應(yīng)的菌株數(shù)/總菌株數(shù)}×100。其中，RS<35%的水稻材料歸為窄抗譜類；35%65%的為廣抗譜類。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖南稻瘟病菌種群分布及出現(xiàn)頻率

在湖南省多個(gè)縣市采集的稻瘟病菌標(biāo)樣，經(jīng)單孢分離獲得303個(gè)有效單孢菌株，于苗期接種至全國(guó)統(tǒng)一的7個(gè)鑒別品種上進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示我省稻瘟病菌分屬 A，B，C，D，E，F(xiàn)，G 等 7群 41個(gè)生理小種，見表1。其中，A 群有 ZA1、ZA3、ZA9、ZA11、ZA13、ZA15、ZA 27、ZA43、ZA57、ZA59 等 10 個(gè)生理小種，共20個(gè)單孢菌株；B群15個(gè)生理小種，共141個(gè)單孢菌株；C群8個(gè)生理小種，共35個(gè)單孢菌株；D群4個(gè)生理小種，共18個(gè)單孢菌株；E群2個(gè)生理小種，共23個(gè)單孢菌株；F群1個(gè)生理小種，共13單孢菌株；G群1個(gè)生理小種，共53個(gè)單孢菌株。就致病力而言，B，A，C種群的分化較強(qiáng)，分別為 15、10、8 個(gè)生理小種，D，E，F(xiàn)，G 群的分化較弱，為 4、2、1、1 個(gè)生理小種。其中，ZG1 為湖南省優(yōu)勢(shì)生理小種，出現(xiàn)頻率為17.49%。其次為ZB13小種，出現(xiàn)頻率為11.55%，見表2。但是ZB種群出現(xiàn)的總頻率高于ZG種群，并且秈型小種出現(xiàn)的頻率高于粳型小種，見表3。這充分反映了稻瘟病菌與大面積抗瘟性水稻品種長(zhǎng)期競(jìng)爭(zhēng)的態(tài)勢(shì)。

2.2 水稻品種湘資3150對(duì)303個(gè)菌株的抗譜

經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定（表4），水稻品種湘資3150對(duì)303個(gè)菌株的抗菌頻率達(dá)到了95.37%，該品種對(duì)其中30個(gè)生理小種的抗菌頻率為100%，對(duì)湖南省的優(yōu)勢(shì)生理小種ZG1，ZB13的抗菌頻率亦為100%。這表明湘資3150抗譜很寬，是良好的抗源品種。

3 小結(jié)與討論

表1 303個(gè)稻瘟病菌菌株的生理小種類型

表2 303個(gè)稻瘟病菌菌株所屬的生理小種的出現(xiàn)頻率

3.1 湖南省稻瘟病菌生理小種研究

稻瘟病菌存在著致病力不同的生理小種，而生理小種的變化和區(qū)系分布是決定水稻品種抗病性的重要因素。因此，探明稻瘟病菌生理小種在湖南省的區(qū)系分布及其消長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)湖南省水稻抗稻瘟病育種、抗病品種的合理布局、病害發(fā)生流行的預(yù)測(cè)及防治均有重要意義。

表3 稻瘟菌種群出現(xiàn)頻率

研究結(jié)果表明，湖南稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，生理小種的數(shù)量較多，以ZG1小種為湖南省優(yōu)勢(shì)小種，但是強(qiáng)致病力的秈型小種出現(xiàn)頻率大于粳型小種。因此，加快培育或引進(jìn)廣譜抗稻瘟病品種已成為當(dāng)務(wù)之急。在選用抗病品種時(shí)，應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)氐牡疚敛【硇》N類型及主要致病小種，合理布局，方能延長(zhǎng)抗病品種的使用年限，有效控制稻瘟病的發(fā)生。

3.2 抗源品種的發(fā)掘與抗性基因

湖南水稻栽培歷史悠久，存在栽培稻、野生稻等各類種質(zhì)資源?？茖W(xué)考察表明，江永縣、茶陵縣至今存在成片生長(zhǎng)的野生稻，在耒陽(yáng)市、永興縣也有“野禾”的分布[6]。野生稻是人工馴化水稻以及進(jìn)行雜交水稻育種的重要資源，亦是發(fā)掘稻瘟病抗源品種的重要途徑。研究所用水稻品種湘資3150，是從野生稻選育而來(lái)的抗源品種，含有豐富的抗性基因，其抗瘟性具有廣譜、持久和穩(wěn)定的特點(diǎn)。此外，試驗(yàn)選用來(lái)自湖南省的稻瘟病菌小種鑒定其抗性，有利于獲得具有地方特色的抗瘟基因，為湖南省抗病育種提供優(yōu)質(zhì)、有效的基因資源。

表4 水稻品種湘資3150對(duì)308個(gè)菌株的抗譜

[1] Couch B C,Hohn L M.A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species,Magnaporthe oryzae,from M.grisea[J].Mycologia,2002,94：683-693.

[2] Ou S H.Rice Diseases[M].2nd ed.Kew,England:Commonwealth Mycological Institute,1985:109-201.

[3] Ou S H.Pathogenic variability,and Host Resistance in Rice Blast Disease[J].Ann Rev Phytopathol，1980，18：167-187.

[4] 彭紹裘，劉二明，黃費(fèi)元，等.水稻持久抗瘟性研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1996，23（4）：293-299.

[5] 林代福.單孢分離的眉毛挑針?lè)ㄉ降剞r(nóng) [J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2003，22（5）：462-463.

[6] International Rice Research Institute（IRRI）.Standard Evaluation System for Rice[M].4th Edition.Malina:IRRI,1996.

[7] 全國(guó)稻瘟病生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組.我國(guó)稻瘟病菌生理小種研究.植物病理學(xué)報(bào)，1980，10（2）：71-82.