添加菊科植物黃花蒿乙醇提取物對奶牛乳腺上皮細胞脂肪酸組成的影響

王麗芳 盧德勛 高 民

CLA是一種含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸，具有抗癌、抗動脈粥樣硬化及抗糖尿病等作用的脂肪酸。研究表明，菊科植物或其提取物可以增加乳中CLA的含量（Collomb等，2002；Cabiddu等，2006；Wallace等，2007）。

本試驗采用奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)法，研究添加菊科植物黃花蒿乙醇提取物對乳腺上皮細胞中CLA和其它脂肪酸組成的影響，旨在探討菊科植物黃花蒿乙醇提取物對奶牛乳腺上皮細胞中CLA合成的作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Forma)、超凈工作臺（DLCJ-2N）、組織培養(yǎng)倒置顯微鏡(Olympuse，日本)、高壓滅菌鍋 (BGSB-3056 HIRAYAMA)、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE）、超純水機（21QX-P1518A Qunxian）、細胞計數(shù)板、電子天平、常溫低速離心機、加樣器、濾器(0.22 μm)、60 公分培養(yǎng)皿(Nuc)、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、D-Hanks液(天津灝洋生物有限公司)、青霉素鈉(Sigma)、硫酸鏈霉素(Sigma)。

1.2 試驗材料

1.2.1 奶牛乳腺組織

乳腺組織來源于一頭健康的泌乳期奶牛。取約1 g的乳腺組織，迅速置于含雙抗的D-Hanks液的滅菌離心管中，帶回實驗室在超凈臺內(nèi)移入含有雙抗的D-Hanks液中反復(fù)沖洗組織，洗凈乳腺組織上殘余的乳汁和血污，盡量除去脂肪組織和結(jié)締組織，然后用眼科手術(shù)剪將組織剪成約1 mm3左右的小塊備用。

1.2.2 組織塊培養(yǎng)

用牙科探針將剪碎的1 mm3左右的組織小塊均勻種植于60 cm2的培養(yǎng)皿中，組織塊間距以0.5 cm左右為宜。種植完成后，蓋好培養(yǎng)皿蓋，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h左右，使組織塊貼壁。然后將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱取出，輕輕加入3～5 ml RPMI1640培養(yǎng)液，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋瓶底上的組織小塊，靜置培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。

1.2.3 黃花蒿乙醇提取物

黃花蒿乙醇提取物的凍干粉用二甲基亞楓(DMSO)溶解，配制成濃度為10 mg/ml的母液，再以細胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度的工作液供試驗用。

1.3 試驗設(shè)計

體外培養(yǎng)奶牛乳腺組織，待細胞生長至對數(shù)增殖期,更換新鮮培養(yǎng)液，隨機分為4組，使黃花蒿乙醇提取物的含量分別為0、2.5、5和10 mg/l組，提取物作用時間均為48 h。然后檢測不同濃度黃花蒿乙醇提取物對奶牛乳腺上皮細胞中脂肪酸含量的影響。

1.4 乳腺上皮細胞中脂肪酸的測定

1.4.1 乳腺上皮細胞中脂肪酸測定的前處理

①取處理好的細胞，加2 ml細胞裂解液，裂解15 min，然后加4 ml正己烷/異丙醇溶液，再加Na2SO4溶液2ml，離心5300 r/min。提取上清液，在20 ml的水解管中，用氮氣吹干試管；

②加入2 ml NaOCH3，在50℃水浴15 min，加入C19:0內(nèi)標(biāo)，然后加入2 ml鹽酸/甲醇溶液，在80℃水浴1.5 h；

③冷卻到室溫，加入3 ml水和6 ml正己烷，震蕩，靜止分層或離心分層；

④吸取上層液體(盡量吸凈)，定容10 ml，加無水硫酸鈉，氣象色譜法測定脂肪酸。

1.4.2 氣相色譜的條件

樣品用氣相色譜分析，此儀器裝有氫火焰離子檢測器。所有樣品的甲基酯用60 m×0.25 mm×0.25 μm柱子(DB-23石英毛細管柱)分離。柱溫采用程序升溫：開始溫度為130℃，保持1 min，以6.5℃/min升至170℃，然后以1.5℃/min升至200℃，保持10 min，再以5℃/min升至最后溫度220℃，保持5 min。載氣是高純氮氣，進樣器和檢測器的溫度是240℃，進樣量 1 μl，分流比為 10： 1。氫氣流量是 30 ml/min，空氣流量是400 ml/min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)基本處理采用Excel 2003，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS進行方差分析，均值的多重比較采用Duncan's法進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加黃花蒿乙醇提取物對乳腺上皮細胞中脂肪酸組成的影響（見表1）

從表1中可以看出，添加黃花蒿乙醇提取物有增加 C12： 0、C14： 0、C14： 1、C16： 1、C18： 2 和 CLA脂肪酸含量的趨勢。其中三個黃花蒿乙醇提取物組顯著增加了乳腺上皮細胞中CLA的含量（P＜0.05）；10 mg/l組顯著增加了C16： 1 的含量（P＜0.05）；5 mg/l組顯著增加了C18：2的含量（P＜0.05）。添加黃花蒿乙醇提取物有降低 C16： 0、C18： 0、t9C18： 1 、c9C18： 1 和t11C18：1脂肪酸含量的趨勢，其中2.5 mg/l組顯著降低了 C18： 0的含量（P＜0.05）；5 mg/l組顯著降低了t9C18:1的含量（P＜0.05）；5 mg/l和 10 mg/l組顯著降低了t11C18： 1脂肪酸的含量（P＜0.05）。

表1 添加黃花蒿乙醇提取物對乳腺上皮細胞中脂肪酸組成的影響

本試驗是直接在乳腺培養(yǎng)細胞中添加黃花蒿乙醇提取物的凍干粉，研究結(jié)果表明添加黃花蒿乙醇提取物顯著增加了CLA含量，三個處理組增加CLA的順序依次是：5 mg/l＞10 mg/l＞2.5 mg/l，而添加黃花蒿乙醇提取物均降低了t11C18：1的含量，降幅順序依次是：5 mg/l＞10 mg/l＞2.5 mg/l。乳中 CLA 主要是通過乳腺組織中硬脂酰輔酶A去飽和酶SCD把t11C18：1作為反應(yīng)底物，在其C-9的位置上脫氫去飽和而生成CLA(Bauman和Griinari,2003)。本試驗5 mg/l組的CLA含量最高，而其t11C18：1含量也最低，說明乳腺細胞中的t11C18：1去飽和生成了CLA而減少了自身的含量，而2.5 mg/l組CLA含量最低，但其t11C18：1含量相比較其它兩個處理組卻最高，說明2.5 mg/l組內(nèi)的t11C18：1去飽和作用也少。但總體而言，三個處理組均增加了乳腺細胞中CLA的含量，這暗示了奶牛乳腺組織培養(yǎng)中添加黃花蒿乙醇提取物有增加SCD酶活性的趨勢。本試驗與王麗芳（2010）奶山羊試驗結(jié)果相反的原因可能是因為奶牛與奶山羊品種不同，或者是因為奶山羊是在日糧中添加黃花蒿乙醇提取物后對乳腺中SCD酶活性的影響，黃花蒿提取物經(jīng)過瘤胃、血液到達乳腺中的成分和本試驗直接添加到乳腺中是有區(qū)別的。

2.2 菊科植物黃花蒿提取物對乳腺細胞中SCD酶去飽和酶指數(shù)的影響（見表2）

從表2中可以看出，添加黃花蒿提取物的三個處理組4個SCD酶去飽和酶指數(shù)均高于對照組，表明添加黃花蒿提取物增加了奶牛乳腺上皮細胞中SCD酶的活力，這與上面添加黃花蒿提取物增加奶牛乳腺上皮細胞中CLA含量的結(jié)果相一致。

表2 黃花蒿提取物對乳腺細胞中SCD酶去飽和酶指數(shù)的影響

SCD酶去飽和酶指數(shù)（SCD酶作用的脂肪酸產(chǎn)物/SCD酶作用的脂肪酸底物）可以反應(yīng)SCD酶活力的高低（Baumgard等，2002）。乳腺中SCD酶有4個主要的作 用產(chǎn)物：C14： 1、C16： 1、c9C18： 1 和 c9,t11-CLA，其相應(yīng)的底物是 C14： 0、C16： 0 、C18： 0和VA。

3 結(jié)論

添加黃花蒿提取物顯著增加了奶牛乳腺上皮細胞中CLA的含量（P＜0.05），可能的原因是黃花蒿提取物增加了SCD酶的活性。

[1]Collomb M,Butikofer U,Sieber R,et al.Correlation between fatty acids in cows'milk fat produced in the LowLands,Mountains and Highlands of Switzerland and botanical composition of the fodder[J].Int.Dairy J.,2002,12:661-666.

[2]A.Cabiddu,M.Addis,G.Pinna,et al.The inclusion of a daisy plant(Chrysanthemum coronarium)in dairy sheep diet.1:Effect on milk and cheese fatty acid composition with particular reference to C18:2 cis-9,trans-11[J].Livestock Science,2006,101:57-67.

[3]R.John Wallace,Estelle Devillard,Stefan Muetzel.Bi0hydrogenation of fatty acids in the rumen.The 6thJoint Symposium of China-Korea-Japan on Rumen Metabolism and Physiology,2007:4

[4]Bauman D E,J.M.Griinari.Nutritional regulation of milk fat synthesis[J].Annu.Rev.Nutr.,2003,23:203-227.

[5]王麗芳.添加菊科植物黃花蒿提取物對奶山羊乳中CLA含量影響及機理研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

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