t10,c12-CLA對豬皮下脂肪和背最長肌組織脂類代謝的影響

杜瑞平 高 民 盧德勛

共軛亞油酸（CLA）是亞油酸（LA）衍生的共軛雙烯的多種位置與空間異構(gòu)體的總稱。理論上其主要位置異構(gòu)有四種即 8，10-、9，11-、10，12-和 11，13-，而每種異構(gòu)體又有四種幾何異構(gòu)體，因此共軛亞油酸的種類十分豐富，但無論是天然的還是人工合成的CLA，只有c-9，t-11和t-10，c-12是其最主要的生物活性異構(gòu)體。近年來，共軛亞油酸(CLA)的生物學功能備受矚目。作為一種新型功能性油脂，共軛亞油酸具有抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病、降低胴體脂肪含量、調(diào)節(jié)免疫、促進生長、增加瘦肉率、改善肉品質(zhì)及影響骨骼形成等諸多生理功能。c9，t11-CLA在提高動物機體的免疫力、抗癌和提高動物的生長性能方面作用較大,而t10,c12-CLA在改變動物機體的脂肪代謝方式以及降低脂肪在動物體內(nèi)的沉積方面起主要作用[1]。

動物體脂的沉積是脂肪合成代謝與分解代謝的一種動態(tài)平衡，其沉積能力包括脂肪的合成、分解和轉(zhuǎn)運三個方面。酶和激素在這些代謝過程中起到了至關(guān)重要的作用[1]。Lin 等（2001）發(fā)現(xiàn)，t10，c12-CLA顯著降低了3T3-L1前脂肪細胞中LPL、FAS和AP2基因 mRNA 的水平[2]。Brandebourg 和 Hu（2005）也報道，CLA通過下調(diào)脂肪分化過程中關(guān)鍵基因的表達抑制豬皮下脂肪前體細胞的分化，進而抑制脂類沉積[3]。那么t10，c12-CLA對豬皮下脂肪和背最長肌兩個部位前脂肪細胞增殖與分化及脂類代謝與沉積的影響是通過怎樣的調(diào)節(jié)機制進行調(diào)控，本試驗即在mRNA水平上研究t10，c12-CLA對脂類代謝關(guān)鍵酶中的脂肪酸合成酶（FAS）、蘋果酸酶（ME）、激素敏感酯酶（HSL）、脂蛋白酯酶（LPL）及脂類代謝調(diào)控激素中的胰島素和生長激素受體（INSR、GHR）的影響，旨在進一步探討CLA對豬皮下脂肪和背最長肌組織脂類代謝的影響并初步揭示其機理。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院豬場30日齡豬。

1.2 試驗試劑

t10，c12-CLA購買自Matreya公司；胰島素、地塞米松、甲基異丁基黃嘌呤、青霉素和鏈霉素購買自Sigma公司；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清白蛋白和膠原酶Ⅱ購買于Gibico公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和普通PCR反應(yīng)所用試劑及定量PCR試劑盒（SYBR Green PCR Kit）購自上海生物工程技術(shù)有限公司；DNA Marker（DL1000）購自 TAKARA 公司，TG測定試劑盒購自北京五洲元業(yè)試劑公司，其余化學試劑購自南京建成生物試劑公司。

1.3 主要溶液配制

DMEM/F12培養(yǎng)液：10.0 g/l DMEM/F12培養(yǎng)基，三蒸水，10%胎牛血清，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，1.2 g/l NaHCO3，過濾（0.22 μm 濾膜）除菌，按每次實驗需要量分裝，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

組織消化液：Ⅱ型膠原酶配成1 mg/ml HBSS液，過濾除菌，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

100 μmol/l CLA 液:先用 100 μl無水乙醇溶解25 mg CLA，加入8.93 ml培養(yǎng)液配成0.01 mol/l的母液，濾菌，-20℃保存，使用時用培養(yǎng)液稀釋即可。

分化儲備液：分別稱取胰島素5.00 mg、地塞米松0.2 mg、甲基異丁基黃嘌呤55.63 mg溶于500 μl無水乙醇中，待完全溶解后加三蒸水至50 ml，濾菌，-20℃保存。

1.4 組織塊培養(yǎng)[4]

（1）無菌切取仔豬肩胛部皮下脂肪約5 g、背最長肌約8 g，75%酒精中浸泡3～5 s，然后用D-Hanks液清洗3次，置于消毒的PBS液中；（2）在培養(yǎng)液或者平衡鹽溶液中分離去除組織中可見的纖維及血管,反復剪切至1 mm3大小為止（呈糊狀）。然后用吸管吸取HBSS液把附著在剪刀上的組織小塊沖下，并補加3～5 ml HBSS液后，去上清，余下的組織塊即可用于培養(yǎng)；(3)用眼科探針將組織小塊均勻擺布于60 cm的培養(yǎng)皿，每小塊間距約0.5 cm，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱1～2 h左右，再向底部輕輕注入5 ml完全培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中靜置培養(yǎng)，開始2 d盡量不去搬動，以利貼壁和生長，培養(yǎng)第3 d換液，此后每2 d換液一次。細胞匯合后用基礎(chǔ)培養(yǎng)液漂洗后（一定不要剩余血清），然后改用無血清分化培養(yǎng)液培養(yǎng)至第10 d。

1.5 TG含量測定

試驗處理第9 d收集各組細胞，超聲波處理，按TG試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)TG含量，結(jié)果以μmol/ml表示。

1.6 熒光定量PCR

1.6.1 引物設(shè)計與合成

登陸NCBI網(wǎng)站查詢相關(guān)基因序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計PCR特異引物，委托上海生物工程公司合成。將凍干粉狀態(tài)的引物離心后，用滅菌超純水配制成 100 μmol/l貯備液和 20 μmol/l工作液，-20 ℃保存。

1.6.2 熒光定量PCR

定量PCR反應(yīng)體系見表2。優(yōu)化反應(yīng)程序如下：（1）95 ℃預變性 15 min；（2）95 ℃變性 30 s；（3）53～60 ℃退火30 s；（4）72 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次；（5）72 ℃延伸1 min；（6）70～95℃生成融解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 試驗設(shè)計

共設(shè)2個處理，處理1為陰性對照（添加0.1mmol/l BSA），處理 2 添加 100 μmol/l的 t10，c12-CLA，每個處理設(shè)6個平行，培養(yǎng)開始即加入BSA與t10，c12-CLA進行處理至第10 d。試驗結(jié)束后收集細胞保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物設(shè)計參數(shù)

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.5軟件中單因素方差分析進行統(tǒng)計。P＜0.05時確定為差異顯著，P＜0.01時確定為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 t10,c12-CLA對豬皮下脂肪和背最長肌內(nèi)脂類代謝關(guān)鍵酶的影響（見圖1）

圖1 脂肪代謝酶FAS、ME、LPL及HSL的相對基因表達水平

圖1為熒光定量PCR測定脂肪代謝關(guān)鍵酶類FAS、ME、LPL及HSL的分析結(jié)果。脂質(zhì)的積累是脂肪合成與分解代謝的動態(tài)平衡結(jié)果，在這一過程中，生脂酶和解脂酶發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)AS與ME是脂肪酸生物合成甘油三酯反應(yīng)的主要限速酶之一，LPL和HSL則是參與脂肪分解過程的關(guān)鍵酶類，它們是脂肪代謝和沉積的系列酶促反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，它們的表達水平和活性高低預示著TG合成的變化。本試驗結(jié)果表明，100 μmol/l t10,c12-CLA顯著抑制了豬皮下脂肪FAS基因表達及背最長肌HSL和LPL基因表達，并顯著提高了豬皮下脂肪HSL基因表達（P＜0.05），兩個部位其它酶基因則無顯著性差異（P＞0.05）。我們由此可以發(fā)現(xiàn)，t10,c12-CLA處理后，豬皮下脂肪的脂肪合成相關(guān)酶（FAS）基因表達顯著下降的同時脂肪分解酶（HSL）基因表達顯著提高，而背最長肌的脂肪分解酶 (HSL、LPL)基因表達則顯著下降，這一變化規(guī)律預示t10,c12-CLA處理后，就酶的作用而言，豬皮下脂肪的脂肪合成代謝弱于分解代謝，而肌內(nèi)脂肪的脂肪合成代謝則強于分解代謝。

2.2 t10,c12-CLA對皮下脂肪和背最長肌組織脂類代謝關(guān)鍵調(diào)控激素的影響

機體對代謝途徑反應(yīng)速度的調(diào)節(jié)控制能力稱為物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)(Metabolic regulation)，生物的進化程度越高，代謝調(diào)節(jié)越復雜，越精細。物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)包括細胞水平、激素水平和整體水平三種調(diào)節(jié)方式[5]。上一小節(jié)關(guān)于酶基因表達即屬于細胞水平調(diào)節(jié)，這一小節(jié)對激素水平進行了研究。與脂肪代謝有關(guān)的激素，包括很多種，生長激素和胰島素是其中重要的兩種，生長激素（GH）有促進脂肪分解、抑制脂肪合成的作用；而胰島素(INS)則有促進生脂、抑制解脂的作用。GH和INS發(fā)揮生理作用的第一步是與靶細胞膜表面的受體(GHR，INSR)結(jié)合，由受體介導將信號傳入胞內(nèi)從而發(fā)揮其生物學功能[6-7]，所以說受體的表達和活性最終反映了相應(yīng)激素的調(diào)節(jié)能力，因此本研究對兩種激素受體GHR和INSR進行了mRNA水平的測定。圖2為熒光定量PCR測定GHR和INSR的分析結(jié)果。結(jié)果表明，100 μmol/l t10,c12-CLA顯著抑制了豬皮下脂肪INSR基因表達，并提高了豬背最長肌INSR基因表達水平（P＜0.05），而兩個部位GHR基因表達的處理組與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。此結(jié)果也說明100 μmol/l t10,c12-CLA通過調(diào)節(jié)豬皮下脂肪和背最長肌組織內(nèi)INSR水平進而影響兩個部位的脂肪代謝。

圖2 GHR和INSR的相對基因表達水平

2.3 t10,c12-CLA對豬皮下脂肪和背最長肌組織TG合成的影響（見圖3）

圖3 t10,c12-CLA對TG含量的影響

前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞后，伴隨分化所發(fā)生的分子事件的最終結(jié)果都表現(xiàn)為細胞內(nèi)TG含量的變化，為定量檢測t10,c12-CLA對皮下脂肪和背最長肌組織脂肪沉積的影響，本試驗采用TG試劑盒測定 TG含量。 結(jié)果表明（見圖 3），100 μmol/l t10,c12-CLA顯著降低了豬皮下脂肪內(nèi)TG含量，而提高了豬背最長肌的的TG含量（P＜0.05）。充分說明t10,c12-CLA抑制了豬皮下脂肪沉積的同時提高了肌內(nèi)脂肪含量。TG的變化規(guī)律也與前面脂肪代謝酶與激素所表明的兩個部位脂肪合成與分解代謝規(guī)律相一致。

2.4 總體討論

關(guān)于CLA對脂肪組織脂質(zhì)代謝和沉積的影響，Evans等（2002）的研究結(jié)果表明，t10，c12-CLA 可減少細胞中甘油三酯含量[8]。Lin 等（2001）發(fā)現(xiàn)，t10，c12-CLA顯著降低了3T3-L1前脂肪細胞中LPL、FAS和AP2基因mRNA的水平[2]。有關(guān)CLA抑制脂肪細胞分化，減少甘油三酯沉積的機理，在鼠上及3T3-L1前脂肪細胞系上的研究表明t10，c12-CLA對脂肪細胞分化以及甘油三酯沉積的抑制主要是由于該單體對前脂肪細胞增殖的抑制以及提高了細胞中脂類的分解[9-10]，而t10，c12-CLA對人脂肪細胞分化和甘油三酯沉積的抑制則主要是通過抑制前脂肪細胞分化過程來實現(xiàn)[11-12]。在豬脂肪體外培養(yǎng)試驗中，有關(guān)CLA調(diào)控作用的報道也不一致[3，13-15]，但正效應(yīng)報道表明，一方面，CLA可以通過抑制豬前脂肪細胞的增殖、分化以及脂類合成的關(guān)鍵酶基因的表達來減少脂肪的沉積；另一方面，CLA通過與脂肪酸氧化分解相關(guān)的酶，如脂酰輔酶A合成酶、脂酰輔酶A脫氫酶等結(jié)合，增強脂肪酸的氧化，從而減少甘油三酯合成。

結(jié)合前面的研究結(jié)果，我們可以這樣認為：t10，c12-CLA顯著抑制和促進豬皮下和背最長肌前脂肪細胞分化和脂類沉積中的關(guān)鍵基因如FAS、INSR、LPL、HSL等的基因表達，從而抑制和促進了前脂肪細胞的分化最終影響其甘油三酯沉積。

3 小結(jié)

本試驗中，100 μmol/l t10,c12-CLA（10 d處理）顯著抑制了豬皮下脂肪FAS、INSR與背最長肌HSL和LPL的基因表達并降低了皮下脂肪的TG含量，同時顯著促進了豬皮下脂肪HSL和背最長肌INSR的基因表達并提高了豬背最長肌的TG含量（P＜0.05）；本研究結(jié)果從脂肪代謝關(guān)鍵酶類及調(diào)控激素角度揭示了t10,c12-CLA對豬皮下脂肪和背最長肌組織脂肪代謝和沉積的差異性調(diào)控機制，進一步證實了t10,c12-CLA抑制豬皮下脂肪沉積同時提高肌內(nèi)脂肪含量。

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