乙型肝炎患者HBV-DNA定量檢測(cè)與HBV血清學(xué)標(biāo)志組合的關(guān)系

彭及良 ，溫秀明 ，許瑞環(huán) ，沈磁石 ，何春輝

（1.廣東省深圳市龍崗區(qū)血站，廣東深圳 518172；2.廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東深圳 518116）

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在臨床應(yīng)用方面的推廣，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) HBV病毒載量已成為目前臨床診斷 HBV感染的常用指標(biāo)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的質(zhì)量。同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)乙型肝炎病毒HBV標(biāo)志（HBV-M）簡(jiǎn)便易行，一直為許多臨床科室使用。臨床上有必要把此兩種方法的檢測(cè)結(jié)果聯(lián)合起來進(jìn)行分析，指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2009年6～9月來我院住院及門診的423例患者，年齡13～66歲。所有標(biāo)本用無菌管留取血樣3 ml，于3 h內(nèi)分離血清，并凍存于20℃冰箱。

1.2 主要試劑

HBV-DNA定量診斷試劑由深圳市匹基生物技術(shù)公司提供。HBV-M測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），試劑由上?？迫A生物工程公司提供。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 ELISA法 按試劑說明書進(jìn)行。

1.3.2 熒光定量PCR法檢測(cè)HBV-DNA①樣本處理，取待測(cè)血清或血漿樣本以及試劑及試劑盒中的對(duì)照各100μl，分別加到0.5 ml離心管中，100μl DNA提取液1，振蕩混勻，13 000 r/min離心 10 s，25μl DNA 提取液 2，振蕩 10 s，200 r/min 離心 10 s，100℃干浴或沸水浴 10 s，13 000 r/min離心10 s，保留上清備用。②反應(yīng)體系為40μl：37.6μl PCR反應(yīng)液、0.4μl Taq酶、0.06μl VNG及2μl提取物。③循環(huán)條件為：37℃ 5 min、94℃ 1 min、95℃ 5 s，60℃ 30 s 42 個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)收集在60℃。

1.3.3 污染的控制 標(biāo)本的處理、試劑的配制、上樣及PCR擴(kuò)增檢測(cè)嚴(yán)格分室進(jìn)行，每次檢測(cè)均設(shè)強(qiáng)陽(yáng)性、臨界陽(yáng)性、陰性、質(zhì)控試劑參照品。

1.4 檢測(cè)儀器

美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的ABI7500熒光定量PCR儀，芬蘭Labsystems生產(chǎn)的Multiskan MK 3酶標(biāo)儀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg（+）組與 HBsAg（-）組 HBV-DNA 陽(yáng)性率的比較

324例血清標(biāo)本HBV-DNA表達(dá)情況見表1。

表 1 HBsAg（+）組與 HBsAg（-）組 HBV-DNA 陽(yáng)性率的比較（%）Tab.1 The comparasion of HBV-DNA between HBsAg（+）group and HBsAg（-）group(%)

由表1可見，HBsAg（+）組HBV-DNA陽(yáng)性率為78.4%，有21.6%的陰性率。HBsAg（-）組HBV-DNA陰性率為95.1%，有4.8%的陽(yáng)性率，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果

324例血清標(biāo)本HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Theresultsof HBV-DNA under HBV different serological makers

由表2可見血清HBsAg HBeAg HBcAb陽(yáng)性組合HBVDNA陽(yáng)性率為 100.0%，拷貝數(shù)達(dá)到 1.61×107拷貝/ml。HBsAg、HBcAb、HBsAg HBeAb HBcAb、HBsAb、HBeAb、HB-cAb陽(yáng)性率依次降低。

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)乙型肝炎病毒已成為臨床常規(guī)。乙肝五項(xiàng)的檢測(cè)為臨床提供一定的信息[1-3]，但對(duì)HBsAg陰性者，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有5%的 HBV-DNA陽(yáng)性，且拷貝數(shù)在104拷貝/ml左右，與某些文獻(xiàn)報(bào)道相似[4-5]。其原因可能由于：①HBV發(fā)生變異，其前S區(qū)變異率比S區(qū)高2倍；前C/C區(qū)變異研究較多。②HbsAg的表達(dá)可能較低或其抗原性改變較大，用現(xiàn)有的試劑檢測(cè)不出。③形成免疫復(fù)合物，有人發(fā)現(xiàn)血中免疫復(fù)合物的存在可能影響HbsAg的檢出[6]。

乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)可真實(shí)反映HBV感染的狀況[7-9]，本試驗(yàn)結(jié)果為 HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA全部陽(yáng)性，平均含量為 1.61×107拷貝/ml；HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA 陽(yáng)性率為 47.0%，平均含量為 3.42×104拷貝/ml；HBsAg（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA陽(yáng)性率為69.0%，平均含量為6.32×104拷貝/ml，而 HBsAb（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的患者血清，HBV-DNA陽(yáng)性率為5.2%，平均拷貝數(shù)為4.12×104拷貝/ml，由此可以看出血清中乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)與其血清學(xué)指標(biāo)組合是相匹配的，對(duì)乙型肝炎的臨床診斷，特別是對(duì)其療效有較大的指導(dǎo)意義[10-11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBsAg（+）HB cAb（+）的陽(yáng)性率為 69.0%，比 HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）的陽(yáng)性率（47.0%）高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），有兩種可能解釋，一是HBV復(fù)制減少或停止，一是HbsAg前C基因發(fā)生變異。根據(jù)Ferruccio Bonino來華報(bào)道，急性乙型肝炎時(shí) HBV 標(biāo)志物的變化圖顯示 HBsAg（+） HBeAb（+）HBcAb（+）時(shí)的 HBV-DNA 陽(yáng)性率明顯低于 HBsAg（+）HBcAb（+）時(shí)的HBV-DNA陽(yáng)性率。

本實(shí)驗(yàn)所用的BIO-RADicycler熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，克服假陽(yáng)性結(jié)果，無需PCR后處理，防污染效果好，可直接反映病毒在體內(nèi)的存在情況，已為臨床普遍應(yīng)用。血清學(xué)ELISA方法是檢測(cè)病毒侵染機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，間接反應(yīng)病毒的感染狀況。對(duì)于 HBeAg與 HBV病毒載量之間的關(guān)系，一般認(rèn)為兩者的水平存在一定程度的一致性。本試驗(yàn)顯示兩者既有相關(guān)，又不盡一致，臨床上需要將兩者結(jié)合起來對(duì)患者進(jìn)行診斷和治療。

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