La(C7H 5O3)2·(C9H 6NO)抑制 Hela 細胞生長作用機制研究

張 輝 ，喻莉萍 ，李 旭 ，胡吉林 ，何志雄 ，林應(yīng)標 ，劉巧突 ，李強國

（1.湘南學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系藥學(xué)教研室，湖南郴州 423000；2.湘南學(xué)院圖書館，湖南郴州 423000；3.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖南郴州 423000）

La(C7H5O3)2·(C9H6NO)是將七水氯化鑭與水楊酸、8-羥基喹啉反應(yīng)合成的鑭與水楊酸、8-羥基喹啉三元混合配合物，為一種人工合成的稀土配合物。水楊酸是常用的抗感染藥物[1]，喹啉衍生物則具有較好的抗菌、抗腫瘤作用[2]，稀土和許多生物分子有親和力，并能參與重要的生命過程，對多種酶或酶原具有激活或抑制作用，有明顯的抗菌活性[3]。我室最近的研究顯示，該配合物具有抗真菌和細菌的作用[4]，也具有促細胞凋亡作用[5]。然而La(C7H5O3)2·(C9H6NO)促凋亡的作用機制尚不清楚。本研究通過探討La(C7H5O3)2·(C9H6NO)對Hela細胞生長狀態(tài)的影響及其作用機制，旨在闡明La(C7H5O3)2·(C9H6NO)是否通過阻滯腫瘤細胞周期而選擇性地誘導(dǎo)凋亡以抑制細胞增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

Hela細胞購自中國醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)教研室，七水氯化鑭（上海試劑公司，分析純），水楊酸（上海試劑公司，分析純），8-羥基喹啉（上海試劑公司，分析純），AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒為北京寶賽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，RPMI 1640 培養(yǎng)基為 GIBCO-BRL（Grand Island，NY，USA）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)溶液的 配制 將 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)溶于 DMSO溶液中，配制成 1 g/L的母液，貯存于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 Hel a細胞的培養(yǎng)條件[6]Hela細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、50 ml/L CO2條件下培養(yǎng)。實驗時細胞處于對數(shù)生長期，活細胞數(shù)超過95%，在含1%胎牛血清的RPMI 1640中饑餓培養(yǎng)24 h后，于培養(yǎng)瓶中分別加入含不同實驗濃度的 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)（0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L）的培養(yǎng)液，分別在24 h及48 h換同樣濃度的加藥培養(yǎng)液，以未加La(C7H5O3)2·(C9H6NO)干預(yù)的細胞為對照組。

1.2.3 MTT法測定La(C7H5O3)2·(C9H6NO)對Hel a細胞增殖活性的影響 根據(jù)以往文獻[7]，96孔板細胞接種密度為每孔2×103個，24 h 后加入實驗濃度 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)培養(yǎng)液，選擇 570 nm 波長，在加藥前和加藥后 24、48、72、96 h分別測定光吸收值A(chǔ)。實驗結(jié)束后，計算細胞生長率。生長率=（A處理細胞-A未處理細胞）/A未處理細胞×100%。 實驗重復(fù) 3 次，取平均值進行分析。

1.2.4 FCM檢測細胞周期 細胞傳代24 h后，在含1%胎牛血清的RPMI 1640中饑餓培養(yǎng)24 h后，加入實驗濃度的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)培養(yǎng)液，72 h后收集細胞，根據(jù)以往文獻方法[8]檢測細胞周期。實驗重復(fù)3次，取平均值進行分析。

1.2.5 Annexi nⅤ-FITC細胞凋亡檢測[9]收集La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用72 h的細胞，調(diào)整細胞濃度為1 000個/L，PBS洗滌2次，取1 ml細胞懸液按照試劑盒說明進行凋亡檢測。AnnexinⅤ陽性且PI陰性判斷為早期凋亡。實驗重復(fù)3次，取平均值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，經(jīng)SPSS 12.0軟件分析，采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 La(C7H5O3)2·(C9H 6NO)對細胞增殖的影響

5.0 、10.0 μmol/L 的 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理 72 h 后，Hela細胞的生長增殖活性開始受到抑制；處理96h后，1.0μmol/L的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)也能抑制Hela細胞的生長增殖活性。結(jié)果表明，隨著La(C7H5O3)2·(C9H6NO)濃度的增加及作用時間的延長，其抑制作用顯著增強，呈濃度及時間依賴效應(yīng)。見表1。

表1 不同濃度的La(C7H5O3)2·(C9H6NO)在不同時點對Hela細胞生長率的影響（x±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of La(C 7H5O3)2·(C9H6NO)in different times on the growth rate of Hela cells(x±s,%)

2.2 La(C7H5O3)2·(C9H 6NO)對細胞周期的影響

Hela 細胞經(jīng) La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用 72 h 后，1.0、5.0、10.0μmol/L組G0/G1期的細胞數(shù)量逐漸增多，S期細胞數(shù)量下降，與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 Hela細胞經(jīng)La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理72 h后細胞周期的變化（x±s，%）Tab.2 Changes in cell cycle of Hela cells treated with La(C7H5O3)2·(C9H6NO)for 72 hours(x±s,%)

2.3 AnnexinⅤ-FITC法檢測細胞凋亡結(jié)果

La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用 96 h 后，1.0、5.0、10.0 μmol/L La(C7H5O3)2·(C9H6NO)組的凋亡率顯著高于對照組（P＜0.01）。見表3。

表3 AnnexinⅤ-FITC檢測La(C7H5O3)2·(C9H6NO)作用96 h后的Hela 細胞凋亡率的變化（x±s，%）Tab.3 Apoptotic rate of Hela cells treated with La(C7H5O3)2·(C9H6NO)for 96 hours detected by AnnexinⅤ-FITC staining(x±s,%)

3 討論

許多用于癌癥化療的細胞毒藥物最終的共同的作用機制都是引起細胞凋亡。各種不同作用靶點的藥物可通過激活不同的信號傳導(dǎo)通路，最后導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[10-12]。

本研究結(jié)果表明，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)對 Hela細胞生長具有抑制作用，隨著藥物濃度由0.5μmol/L增至10.0μmol/L及作用時間由24 h增至96 h，Hela細胞生長抑制作用顯著加強，呈濃度及時間依賴性。細胞周期分析顯示，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理后 G0/G1期細胞數(shù)量顯著增加，S期細胞數(shù)量顯著下降，表明 La(C7H5O3)2·(C9H6NO)可使 Hela細胞周期阻滯于G0/G1期。

由以上結(jié)果可以推斷，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)除具有促凋亡作用外，還能抑制細胞分裂，可能提示La(C7H5O3)2·(C9H6NO)誘導(dǎo)的凋亡和細胞周期阻滯是通過不同的信號傳導(dǎo)機制介導(dǎo)的，哪一種途徑占優(yōu)勢取決于細胞特異的信號通路（細胞類型特異性）和信號受影響的程度（藥物劑量依賴性）?；谏鲜龈鞣N原因，在經(jīng)過La(C7H5O3)2·(C9H6NO)處理后，如果對凋亡信號的影響超過了對細胞周期信號的影響，則細胞將產(chǎn)生凋亡。反之，則引起細胞周期的阻滯；隨著細胞周期阻滯的延長，最終會導(dǎo)致細胞凋亡，但這是通過不同的、間接的信號事件啟動的，是細胞周期進程受到阻滯引起的結(jié)果?？傊?，La(C7H5O3)2·(C9H6NO)可能通過阻滯細胞周期及誘導(dǎo)凋亡來抑制細胞增殖。

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