T-2毒素人工抗原的制備

T-2毒素(T-2 Toxin)是一種真菌毒素，屬于單端孢霉烯族化合物中的A族，是該類化合物中毒性最強(qiáng)的毒素之一，主要由三線鐮刀菌、梨抱鐮刀菌、擬枝抱鐮刀菌和木賊鐮刀菌等霉菌產(chǎn)生。T-2毒素為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)150～151℃，難溶于水，易溶于極性溶劑，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。烹調(diào)過程不易將其破壞。分子式為C24H34O9，分子量為466?；窘Y(jié)構(gòu)為四環(huán)的半倍萜，C-9和C-10位上有不飽和雙鍵，在紫外燈下不顯熒光。T-2毒素的分子結(jié)構(gòu)見圖1[1]。

R1=OH R2=R3=OAc R4=OCOCH2CH(CH3)2

目前國內(nèi)外T-2毒素的檢測方法有很多種，其中TLC法用目測半定量,靈敏度不高,不適于檢測大量樣品，選擇性和敏感性也低，近年來應(yīng)用較少。LC、GC是定量的檢測方法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但檢出限較高，且所用儀器設(shè)備較為昂貴。ELISA法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大量樣品的快速篩選。為了開發(fā)ELISA法，必須首先制成 T-2毒素抗原 。目前，國外合成T-2完全抗原的常用方法主要包括琥珀酸酐(HS)法 、戊二酸酐(HG)法和羧甲基肟(CMO)法[2]，其中羧甲基肟法試劑較貴，琥珀酸酐法和戊二酸酐法比較常用。作者在此對琥珀酸酐(HS)法做了改進(jìn)，成功合成了T-2毒素完全抗原，為獲得T-2毒素單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)、T-2毒素、碳二亞胺(EDPC),Sigma公司；琥珀酸酐(HS)，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；GF254，青島海洋化工廠；羥甲基纖維素鈉(CMCNa)、二甲基酰胺(DMF)、三氯甲烷、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、氯化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

CO2恒溫培養(yǎng)箱(氣套式)，Binder；振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；酶標(biāo)板(96孔)，金燦華實(shí)業(yè)有限公司；紫外分光光度計(jì)、小型高速離心機(jī)，德國Eppendorf；超凈工作臺(tái)，哈爾濱東聯(lián)；核酸電泳儀，六一儀器廠；Alpha Imager 2200型凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha Innotech Corporation；ELX800型酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；Astell高壓滅菌鍋，Mettler。

1.2 T-2HS的制備

參照文獻(xiàn)[3]，將2 mg T-2毒素和42 mg琥珀酸酐置于0.8 mL吡啶中，在蒸氣浴中反應(yīng)4 h。然后將反應(yīng)混合物于氮?dú)庀麓蹈筛稍?，再溶于適量氯仿。用蒸餾水洗 4次，將氯仿抽提物蒸發(fā)干燥,得T-2HS,用TLC法[以乙酸乙酯∶ 丙酮∶甲醇 (50∶50∶1)為展開劑]檢測。

1.3 T-2BSA偶聯(lián)物的制備

將2 mg T-2HS用0.2 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制得A液；將5 mg BSA、3 mg EDPC加25 mL蒸餾水溶解，制得B液；將A液逐滴加入B液中，邊加邊攪拌，10 min后，加1 mg EDPC，室溫、pH值5.5條件下繼續(xù)攪拌18 h，然后用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH值7.2)透析3 d，每天換液一次。透析后，分裝冷凍干燥保存。

1.4 T-2OVA偶聯(lián)物的制備

將2 mg T-2HS用0.2 mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制得A液；將5 mg OVA、3 mg EDPC加25 mL蒸餾水溶解，制得B′液；將A液逐滴加入B′液中，邊加邊攪拌，10 min后，加1 mg EDPC，室溫、pH值5.5條件下繼續(xù)攪拌18 h，然后用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH值7.2)透析3 d，每天換液一次。透析后，分裝冷凍干燥保存。

1.5 偶聯(lián)比的計(jì)算

對于大分子和小分子的偶聯(lián)物，由于兩種分子均有各自不同的最大紫外吸收峰，根據(jù)波長疊加原理，偶聯(lián)物應(yīng)有不同的紫外吸收峰，且在最大吸收峰波長處的吸光度值與其相應(yīng)的濃度成比例，但在偶聯(lián)物的紫外掃描光譜中，則表現(xiàn)為各自的光譜圖呈疊加性質(zhì)。該法操作簡單且無樣本損耗[4]。實(shí)驗(yàn)所用 T-2HS的濃度為 1 mg·mL-1，BSA和OVA濃度均為1 mg·mL-1。T-2BSA和T-2OVA的濃度為0.5 mg·mL-1，偶聯(lián)比c1/c2計(jì)算如下∶

KAxm=AAxm/(ρx/Mx)

KBxm=ABxm/(ρx/Mx)

式中：c1、c2為偶聯(lián)物中A、B兩種物質(zhì)分子濃度比；AAam、ABam和ACam分別為毒素、蛋白、偶聯(lián)物在小分子毒素T-2HS特征吸收波長處的紫外吸光值；AAbm、ABbm和ACbm分別為毒素、蛋白、偶聯(lián)物在蛋白質(zhì)特征吸收波長處的紫外吸光值；x=a、b，分別代表毒素、蛋白；ρ為濃度，M為摩爾質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 T-2與HS的連接

由TLC可以得到，T-2的Rf=0.729，T-2HS的Rf=0.705，其中T-2的Rf大于T-2HS的Rf值，說明T-2與HS 連接成功，可以繼續(xù)與蛋白OVA和BSA連接。

2.2 T-2HS與蛋白的連接

對T-2HS與蛋白的偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 T-2、T-2HS、BSA和T-2BSA的紫外掃描圖譜

由圖2可以看出，T-2的紫外吸收峰在190 nm左右，T-2HS的紫外吸收峰在209 nm，BSA的紫外吸收峰在275 nm，此處T-2有弱吸收，偶聯(lián)物T-2BSA的紫外吸收峰在276 nm左右，推測為載體和偶聯(lián)于載體上的蛋白的吸收累加所致，表明T-2毒素連接到了載體蛋白上，全抗原合成成功。T-2BSA和BSA的最大吸收峰分別在波長276 nm和275 nm處。計(jì)算T-2與BSA的偶聯(lián)比是6.66∶1。

圖3 T-2、T-2HS、OVA和T-2OVA的紫外掃描圖譜

由圖3可以看出，T-2的紫外吸收峰在190 nm左右，T-2HS的紫外吸收峰在209 nm，OVA的紫外吸收峰在278 nm，偶聯(lián)物T-2OVA的紫外吸收峰在277 nm左右，此處T-2沒有峰，說明該峰是由OVA貢獻(xiàn)，表明T-2毒素接到了載體蛋白上，全抗原合成成功。T-2OVA和OVA的最大吸收峰分別在波長277 nm和278 nm處。計(jì)算T-2與OVA的偶聯(lián)比是10.11∶1。

對T-2HS與蛋白的偶聯(lián)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果見圖4。

1.Marker 2.BSA 3.T-2BSA 4.OVA 5,6.T-2OVA

由圖4可以看出，偶聯(lián)物T-2BSA分子量略大于BSA分子量，說明T-2BSA偶聯(lián)成功。T-2OVA分子量大于OVA分子量，說明T-2OVA偶聯(lián)成功。

2.3 討論

T-2毒素屬于倍半萜烯類化合物，是含有羥基的小分子半抗原，其本身不具有免疫原性，不能像細(xì)菌等天然抗原一樣可單獨(dú)用于動(dòng)物免疫，刺激其產(chǎn)生特異性抗體。因此，獲得T-2抗體的關(guān)鍵是將T-2半抗原與蛋白質(zhì)大分子偶聯(lián)，轉(zhuǎn)變成 T-2完全抗原。本實(shí)驗(yàn)采用琥珀酸酐法制備T-2毒素抗原，即T-2BSA和T-2OVA，預(yù)備用來免疫動(dòng)物以獲得 T-2抗體。

通過紫外和SDS聚丙烯酰胺電泳分析確定人工抗原的分子量。由于半抗原抗體的特異性不僅取決于半抗原整個(gè)分子或部分結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，還與其人工抗原中載體上連接的半抗原數(shù)目有關(guān)，因此在免疫前測定偶聯(lián)比，即合成的人工抗原載體上連接的半抗原數(shù)目，具有特殊意義。本實(shí)驗(yàn)在合成方法上采用氮?dú)獯蹈杀苊庋趸軌蜉^好地制備人工抗原，偶聯(lián)比較好，一般來說當(dāng)半抗原與載體的偶聯(lián)比為(3～45)∶1 時(shí)免疫原性較強(qiáng),在(8～25)∶1時(shí)能得到效價(jià)較高的抗體[5]。本實(shí)驗(yàn)合成的人工抗原T-2BSA和T-2OVA的偶聯(lián)比為 6.66∶1和10.11∶1，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

在蒸氣浴條件下，T-2毒素與琥珀酸酐(HS)反應(yīng)合成了T-2HS，薄層層析顯示，目標(biāo)半抗原合成成功；然后通過碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，采用紫外掃描及SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，T-2HS能與牛血清白蛋白和卵清蛋白結(jié)合生成T-2毒素抗原。紫外掃描分析表明，T-2毒素與牛血清白蛋白的偶聯(lián)比為6.66∶1，與卵清蛋白的偶聯(lián)比為10.11∶1，表明此完全抗原能夠用于免疫動(dòng)物。為進(jìn)一步制備T-2毒素抗體奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Bsuer J.The metabolism of trichothecenes in swine[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,1995，102(1):50-52.

[2] 唐小波.制備T-2毒素抗體方法研究進(jìn)展[J].中國地方病學(xué)雜志，1998，17(2):124-126.

[3] Zhang Guang-shi,Schubring Susan L,Chu F S,et al.Improved method for production of antibodies against T-2 toxin and diacetoxyscirpenol in rabbits[J].Applied and Environmental Microbiology,1986,51(1):132-137.

[4] Altieri S L,Khan A,Nazmul H,et al.Exosomes from plasmacytoma cells as a tumor vaccine[J].J Immunother,2004,27(4):282-288.

[5] Erlanger B F.The preparation of antigenic hapten-carrier conjugate：A survey[J].Methods in Enzymology,1980，70:70-74.