犬體細(xì)胞克隆研究

王倫學(xué)，李 力，谷穎樂，徐永莉，張?jiān)略?，趙成堅(jiān)

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所 廣西分所；廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023）

犬體細(xì)胞克隆研究

王倫學(xué)，李 力，谷穎樂，徐永莉，張?jiān)略疲w成堅(jiān)

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所 廣西分所；廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023）

克隆是由英文單詞“clone”音譯而來，來自希臘語“klon”，本意是扦插枝條，即無性繁殖?，F(xiàn)在所說的克隆多是指動(dòng)物體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT），即把動(dòng)物體細(xì)胞核移植入去核的動(dòng)物卵母細(xì)胞中，構(gòu)建新的重組胚胎，進(jìn)而使重構(gòu)胚胎發(fā)育為與供體核細(xì)胞基因型相同后代的技術(shù)過程。動(dòng)物體細(xì)胞克隆可以使動(dòng)物不需要經(jīng)過有性繁殖，即不需要雄性動(dòng)物的精子和雌性動(dòng)物的卵母細(xì)胞的受精過程而產(chǎn)生動(dòng)物后代。

1997年英國羅斯林研究所Wilmut等成功獲得世界首例體細(xì)胞克隆綿羊（Dolly），打破了長期以來認(rèn)為成年動(dòng)物體細(xì)胞不具備發(fā)育全能性的假說?？寺⊙颉岸嗬颉钡恼Q生使人們相信，高度分化的成年動(dòng)物體細(xì)胞可以在體外通過核移植技術(shù)實(shí)現(xiàn)其發(fā)育成新個(gè)體的潛能。在此理論基礎(chǔ)上，自1997年以來，相繼在羊[1-3]、牛[4，5]、豬[6]、小鼠[7-9]、兔[10]、馬[11]等物種上成功得到克隆動(dòng)物后代。

目前，動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的主要環(huán)節(jié)包括：供體細(xì)胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備、受體卵母細(xì)胞的體外成熟及去核、供體細(xì)胞核移植入去核卵母細(xì)胞中、重構(gòu)胚胎的融合和激活、重構(gòu)胚胎的體外發(fā)育以及重構(gòu)胚胎移植入受體動(dòng)物中并妊娠產(chǎn)仔。在2006年，世界首例體細(xì)胞克隆犬獲得成功[12，13]。他們把重構(gòu)胚胎經(jīng)過融合激活后不經(jīng)過體外發(fā)育而直接移植入受體母犬中妊娠，進(jìn)而發(fā)育成新個(gè)體[12，13]。

綜合各種動(dòng)物克隆方法和效率，犬體細(xì)胞克隆效率較低，難度大。如犬卵母細(xì)胞體外成熟效率低，犬卵母細(xì)胞核相（胚胎細(xì)胞核）觀察效率低，體外胚胎培養(yǎng)體系不完善，重構(gòu)胚胎很難進(jìn)行體外發(fā)育。以下詳細(xì)介紹目前影響犬體細(xì)胞克隆的因素。

1 影響犬體細(xì)胞克隆的因素

1.1 超數(shù)排卵和卵母細(xì)胞質(zhì)量

犬卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）效率比其它哺乳動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低[14-25]。至目前無利用體外成熟卵母細(xì)胞獲取克隆犬報(bào)道。為充分利用寶貴資源，使用更多成熟卵母細(xì)進(jìn)行克隆犬研究，科學(xué)家使用激素誘導(dǎo)母犬發(fā)情，超數(shù)排卵以獲取體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞[12，13]。其中，GJang等已找出了成熟的超排方法。

G Jang等超排獲取卵母細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，依據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，即卵周縫（PVS）大小及第1極體存在與否，來判斷卵母細(xì)胞成熟狀態(tài)。從圖1可以看出，未成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)黑但不均勻致密，成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)黑而均勻致密，而早期老齡化卵母細(xì)胞、中等老齡化卵母細(xì)胞及嚴(yán)重老齡化卵母細(xì)胞中卵周隙逐漸增大，透明帶和卵丘細(xì)胞也逐漸老化。另外，上述研究發(fā)現(xiàn)，超數(shù)排卵72 h后，從犬輸卵管中沖洗出卵母細(xì)胞，此期卵母細(xì)胞質(zhì)量最高，用此時(shí)期卵母細(xì)胞做受體構(gòu)建的重構(gòu)胚在代孕受體中妊娠率會(huì)較高。

圖1 排卵后約72 h從輸卵管中沖出的體內(nèi)成熟的各時(shí)期卵母細(xì)胞

1.2 融合、激活、胚胎移植

G Jang等對(duì)犬重構(gòu)胚融合、激活及胚胎移植方法進(jìn)行了探索。在重構(gòu)胚激活方面，他們發(fā)現(xiàn)化學(xué)激活法比電激活法優(yōu)越。經(jīng)過融合和激活的重構(gòu)胚直接移植入受體中而未進(jìn)行體外培養(yǎng)。另外，隨體外手術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累，從輸卵管中獲取卵母細(xì)胞及胚胎移植所需時(shí)間已大大縮短，胚胎移植部位和方法也得到較大改進(jìn)。

1.3 胎兒流產(chǎn)、畸形

G Jang等用超聲波觀察妊娠代孕母犬，從妊娠第23天直至出生都無發(fā)生流產(chǎn)現(xiàn)象，所生犬仔體重正常，生長及活動(dòng)正常。他們認(rèn)為這與采用體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞作核受體有關(guān)。而在豬、牛、羊等大動(dòng)物克隆中，多數(shù)都采用從屠宰場卵巢中獲取卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞體外成熟，去核作為核受體，克隆胎兒較高發(fā)生流產(chǎn)和胎兒畸形等癥狀。建議此研究需比較體內(nèi)外來源犬卵母細(xì)胞克隆效率產(chǎn)生差異，并找出確切原因，為其它動(dòng)物體細(xì)胞克隆研究做參考。

2 克隆犬效率和方法

目前，通過體細(xì)胞克隆技術(shù)成功獲得克隆犬的分別是WooSuk Hwang和GJang（見圖2）。在克隆犬效率上（產(chǎn)仔數(shù)與受體數(shù)比值），G Jang高于WooSuk Hwang（25.00%∶1.6%）。

圖2 已獲得的體細(xì)胞克隆犬及供體犬和代孕犬

下面簡要介紹兩者克隆方法異同點(diǎn)：（1）供體細(xì)胞：WooSuk Hwang采用雄性阿富汗獵犬耳朵成纖維細(xì)胞，細(xì)胞體外培養(yǎng)72 h。GJang采用2月齡成年雌性阿富汗獵犬耳朵成纖維細(xì)胞，其中1～3代細(xì)胞放置在液氮中冷凍，3～8代細(xì)胞用于核移植。（2）卵母細(xì)胞來源:兩者都采用超排成年母犬（排卵點(diǎn)開始計(jì)算）一段時(shí)間（G Jang采用超排72 h）后從犬輸卵管中收集卵母細(xì)胞。在超排效率上，G Jang從23只母狗中獲取167枚卵母細(xì)胞，平均每只母犬獲取726枚卵母細(xì)胞。Woo Suk Hwang平均每只母犬獲取12枚卵母細(xì)胞。前者明顯低于后者。（3）去核和顯微注射方法：都是通過顯微注射方法把供體細(xì)胞注入已去核受體犬卵母細(xì)胞中。（4）初生體重和妊娠：兩者所生犬仔體重正常，妊娠期都在60 d左右。（5）克隆后代：從兩者照片可以發(fā)現(xiàn)，WooSuk Hwang所克隆的雄性阿富汗獵犬外表華貴，而G Jang克隆的雌性阿富汗獵犬外表普通。表明阿富汗獵犬品種較多。Woo Suk Hwang所生的第2只克隆犬仔在第1周患呼吸道病，于出生后22天死亡，但解剖后沒發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)異常。（6）檢測手段：為了檢測所生克隆犬仔是否與供體犬具有相同基因組，WooSuk Hwang對(duì)克隆犬和供體雄性犬進(jìn)行了基因組DNA微衛(wèi)星檢測，共檢測了8對(duì)犬特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)，最后確認(rèn)克隆犬與供體犬基因組一致。GJang比較了供體犬、克隆犬和代孕母犬成纖維細(xì)胞和血液細(xì)胞基因組是否相同，共檢測14個(gè)犬特異性標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)供體犬和克隆犬?dāng)U增片段大小相同，表明克隆犬基因組完全來自供體犬。表1具體比較兩者采用方法及效率。

3 異種克隆

異種體細(xì)胞核移植技術(shù)又稱異種克隆。是把一種動(dòng)物體細(xì)胞核移植到另一種動(dòng)物去核卵母細(xì)胞中，構(gòu)建異種重構(gòu)胚，異種重構(gòu)胚中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分別來自兩個(gè)不同的物種，異種重構(gòu)胚體外發(fā)育并移植入受體動(dòng)物中產(chǎn)下與供核基因組相同動(dòng)物。異種克隆在研究細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系，拯救瀕危野生動(dòng)物及人類胚胎干細(xì)胞方面具有特殊意義。

異種細(xì)胞核移植技術(shù)最早在魚類和兩棲類上開展研究[26-28]，最近幾年在哺乳動(dòng)物上研究才有報(bào)道。DominkoT等把野牛、綿羊、豬、猴和大鼠的體細(xì)胞作供體移入牛去核卵母細(xì)胞中[29]，重構(gòu)胚均能發(fā)育至囊胚，前四種動(dòng)物異種重構(gòu)胚的囊胚率分別達(dá)到17.3%，13.9%，14.3%和16.6%，并且綿羊和野牛體細(xì)胞作供體重構(gòu)胚移植入受體均能發(fā)育至妊娠階段。陳大元利用大熊貓?bào)w細(xì)胞作核供體，移入去核貓和兔卵母細(xì)胞中，重構(gòu)胚胎在體外均能發(fā)育至囊胚期。用貓作為代孕受體能在子宮中附植并能發(fā)育，但不能產(chǎn)下克隆后代[30]。因此需深入研究異種克隆機(jī)理以提高異種克隆效率。

1758年著名博物學(xué)家林奈在他的《自然系統(tǒng)》一書中把犬從狼和其他犬屬動(dòng)物分列出來，視其為一個(gè)馴化了的種，稱為家犬。而美國科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，所有犬種都是由一種東亞狼進(jìn)化而來。并且在2002年，中國和瑞典科學(xué)家已有研究證實(shí)，全世界犬具有相同遺傳基因，都起源于東亞，之后才逐漸擴(kuò)散到世界各地。因此，有關(guān)狼與犬在進(jìn)化和種間關(guān)系存在爭議，需做進(jìn)一步闡明。在2005年韓國科學(xué)家用狼體細(xì)胞做供體，以犬卵母細(xì)胞作受體成功克隆出狼，間接表明狼和犬遺傳物質(zhì)相似性。此研究為保護(hù)瀕危動(dòng)物提供了新方法。

2005 年，Murakami等比較了狗（Canis familiaris）- 牛 （Bos taurus）、牦牛 （Bos grunniens）- 牛（Bos taurus）、牛（Bos taurus）- 牛（Bos taurus）3 種異種重構(gòu)胚體外發(fā)育能力[31]。發(fā)現(xiàn)用犬卵丘細(xì)胞作為核供體移植入牛卵母細(xì)胞中，75%重構(gòu)胚能體外融合并發(fā)育至2細(xì)胞和8細(xì)胞時(shí)期，其比例分別達(dá)到73.9%和52.6%。而桑葚胚率和囊胚率僅為1.3%和0.4%。由此研究可得出犬異種重構(gòu)胚體外發(fā)育停滯在8細(xì)胞期。因此需要深入研究8細(xì)胞停滯原因，并克服8細(xì)胞停滯現(xiàn)象，探索出優(yōu)良的胚胎培養(yǎng)體系以提高異種克隆胚胎囊胚率。

綜上所述，犬體細(xì)胞克隆及異種克隆研究相對(duì)匱乏，在克隆機(jī)理方面更需深入研究。目前研究已表明，犬卵母細(xì)胞能夠支持供體細(xì)胞發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體，為犬異種克隆研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

表1 狗體細(xì)胞克隆方法效率比較

4 克隆犬發(fā)展前景

犬是犬科動(dòng)物中較早被馴化的，與人類關(guān)系親近。根據(jù)考古學(xué)記載，自1萬5 000年以前，犬就與人類結(jié)下不解之緣。2005年12月8日美國科學(xué)家在《自然》雜志上宣布[32]，研究人員成功破解犬的全部基因密碼，并發(fā)現(xiàn)在1.93萬個(gè)犬的基因中，至少有1.8 473萬個(gè)與已經(jīng)識(shí)別的人類基因相同，這表明人與犬不但有共同祖先，而且親緣關(guān)系較近，犬中多數(shù)遺傳疾病與人類遺傳疾病相似。因此，體細(xì)胞核移植技術(shù)在犬上有以下幾個(gè)方面應(yīng)用前景：（1）利用動(dòng)物克隆技術(shù)可以拯救瀕危犬科動(dòng)物。（2）利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆犬，生產(chǎn)具有重要藥用價(jià)值的活性物質(zhì)。（3）利用優(yōu)良犬品種體細(xì)胞作核供體克隆優(yōu)秀子代動(dòng)物，可以避免自然條件下選種所受動(dòng)物生殖周期和生育效率限制，大大縮短育種年限，提高育種效率。（4）疾病模型和機(jī)理研究。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)，轉(zhuǎn)入與腫瘤和癌發(fā)生有關(guān)基因，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，研究基因表達(dá)和調(diào)控規(guī)律，為腫瘤和癌癥治療提供依據(jù)。

［1］Wilmut I，Schnieke A E，McWhir J.et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature，1997，385:810-813.

［2］BaguisiA，BehboodiE，MelicanDTetal.Productionofgoats bysomaticcellnucleartransfer[J].NatBiotechnol，1999，17:456-461.

［3］Keefer C L，Baldassarre H，Keyston R，et al.Generation of dwarf goat（Capra hircus）clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitromaturedoocytes[J].BiolReprod，2001，64:849-856.

［4］Cibelli.，J.B，Stice，S.Glueke，P.J.，et al..Cloned transgenic calves produced from Non-quiescent fetal fibroblasts[J].Science，1998，280:1256-1258.

［5］Wells D N，Misica P M，Tervit H R.Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosacells[J].Biol Reprod，1999，60:996-1005.

［6］Polejaeva I A，Chen S H，Vaught T D，et al.Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nature，2000，407:86-90.

［7］T.Wakayama.，et al.Full-term development of mice from nucleated oocyte injected with cumulus cellnuclei[J].Nature，1998，394:369-374.

［8］Wakayama T，Shinkai Y，Tamashiro KL，et al.Cloning of micetosixgenerations[J].Nature，2000，407:318-319.

［9］Ono Y，Shimozawa N，Ito M，et al.Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer[J].BiolReprod，2001，64:44-50.

［10］Chesne P，Adenot P G，Viglietta，et al.Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nat Biotechnol，2002，20（4）:366-369.

［11］Xihe Li，Lee H A，Allen W R.2002.In vitro development of horse oocytes reconstructed with the nuclei offetal and adult cells[J].BiologyofReproduction，66:189-193.

［12］Byeong Chun Lee，Woo Suk Hwang et al.Dogs cloned from adultsomaticcells[J].Nature436，641（2005）.

［13］G Jang，B C Lee.Birth of viable female dogs produced by somaticcellnucleartransfer[J].Theriogenology2006.

［14］MahiCA，YanagimachiR.Maturation and spermpenetration of canine ovarian oocytes in vitro[J].J Exp Zool 1976；16:189-93.

［15］Yamada S，Shimazu Y，Kawano Y，et al.Maturation，fertilizationanddevelopmentofoocytesinvitro[J].BiolReprod 1992；46:853-8.

［16］Yamada S，Shimazu Y，KawanoY，et al.In vitromaturation andfertilizationofpreovulatorydogoocytes[J].JReprod Fertil 1993；47（Suppl）.:227-9.

［17］Nickson DA，Boyd JS，Eckershall PD，et al.Molecular biological methods for monitoring oocyte maturation and in vitro fertilization in bitches[J].J Reprod Fertil 1993；44（Suppl）.:231-40.

［18］HewittDA，EnglandGCW.Theeffectofoocytesizeandbitch age upon nuclear maturation in vitro[J].Theriogenology 1998；49:957-66.

［19］Hewitt DA，England GCW.Synthetic oviductal fluid and oviductal cell coculture for canine oocyte maturation in vitro[J].AnimReprodSci1999；55:63-75.

［20］Metcalfe SS.Assisted Reproduction in the Bitch.Thesis for the degree ofMaster ofScience.Victoria，Australia:Monash University；1999.160.

［21］Otoi T，F(xiàn)ujii M，Tanaka M，et al.Effect of serum on the in vitro maturation of canine oocytes[J].Reprod Fertil Dev 1999；11:387-90.

［22］Otoi T，F(xiàn)ujii M，Tanaka M，et al.Canine oocyte diameter in relation to meiotic competence and sperm penetration[J].Theriogenology2000；54:535-42.

［23］Otoi T，Ooka A，Muramaki M，et al.Size distribution and meiotic competence ofoocytes obtained frombitch ovaries al variousstagesoftheestruscycle[J].Reprod FertilDev2001；13:151-5.

［24］N.Songsasen，I.YU，SP Leibo.Nuclear Maturation ofCanine OocytesCultured in Protein-Free Media.Molecular ReproductionAndDevelopment，2202，62:407-415.

［25］Monica De los Reyes，Johanna de Lange，Pedro Miranda，Jaime Palominos，ClaudioBarros.Effect ofhuman chorionic gonadotrophin supplementation during different culture periods on in vitro maturation of canine oocytes[J].Theriogenology，64（2005）1-11.

［26］童第周，吳尚勤，等.細(xì)胞核的移植.動(dòng)物學(xué)報(bào)，1963，15（1）:151.

［27］童第周，等.魚類不同亞科間的細(xì)胞核移植[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，1973，19:201.

［28］Briggs R，KingTJ.Transplantation oflivingcell nuclei from blastulacellsintoenucleatedfrog'seggs[J].ProcNatlAcadSci USA，1952，38:455-463.

［29］Dominko T，Mitalipova M，Haley.Bovine oocyte cytoplasm support development of embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei from various mammalian species[J].BiolReprod，1999，60:1496-1502.

［30］陳大元，孫青原，劉冀瓏.大熊貓供核體細(xì)胞在兔卵胞質(zhì)中可去分化而支持早期重構(gòu)胚發(fā)育[J].中國科學(xué)，C輯，1999，29（3）:324-330.

［31］Masao Murakami，Takeshige Otoi，Pimprapar Wongsrikeao etal.DevelopmentofInterspeciesClonedEmbryoinYakand Dog[J].CLONINGANDSTEMCELLS.Volume7，Number 2，2005.

［32］朱翔.美科學(xué)家成功繪制犬類基因組圖譜.北京科技報(bào).2005，12，14，第 13版.

S829.2

B

1005-2739（2010）02-0008-04

2009-11-02

王倫學(xué)，男，博士，助理研究員。