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    順鉑對離體C57小鼠耳蝸毛細(xì)胞的損害作用

    2010-06-05 15:31:01曾珊于棟禎陳正儂陳斌
    聽力學(xué)及言語疾病雜志 2010年4期
    關(guān)鍵詞:基底膜毛細(xì)胞離體

    曾珊 于棟禎 陳正儂 陳斌

    順鉑對離體C57小鼠耳蝸毛細(xì)胞的損害作用

    曾珊1于棟禎1陳正儂1陳斌1

    目的 探討離體培養(yǎng)條件下順鉑致C57小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的特點(diǎn)。方法 出生后3~4天的C57小鼠耳蝸基底膜離體培養(yǎng)6~8小時(shí)后,加入不同濃度的順鉑(0、10、50、100、400、1 000μmol/L)無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),其中0μmol/L為正常對照組,10~1 000μmol/L組為實(shí)驗(yàn)組,0~100μmol/L4組,每組各7只耳蝸,400和1 000μmol/L兩組各6只耳蝸。采用TRITC-Phalloidin和DAPI染色,熒光顯微鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞生長情況并拍照計(jì)數(shù)、繪制毛細(xì)胞缺失圖,運(yùn)用SARS 8.0軟件進(jìn)行直線回歸分析比較各組的毛細(xì)胞缺失率。結(jié)果對照組耳蝸基底膜毛細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下生長良好,偶見缺失。實(shí)驗(yàn)組中順鉑引起毛細(xì)胞的缺失程度從底回至頂回大致均勻。隨著順鉑濃度從10μmol/L增加到100μmol/L,毛細(xì)胞的缺失率從14.5%上升到78.4%;順鉑濃度升高至400μmol/L及1 000μmol/L時(shí),毛細(xì)胞缺失率下降至48.8%和8.77%。細(xì)胞缺失區(qū)域可見DAPI著色的濃縮核。結(jié)論 離體培養(yǎng)條件下,順鉑對耳蝸毛細(xì)胞的損傷在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性,超過一定劑量后順鉑所致毛細(xì)胞損傷又逐漸減少;內(nèi)外毛細(xì)胞的損傷從底回至頂回呈現(xiàn)均一性。

    聽毛細(xì)胞; 耳蝸; 器官培養(yǎng); 順鉑

    順鉑是一種廣泛使用的化療藥物,可以有效地治療卵巢癌、睪丸癌、宮頸癌、肺癌、膀胱癌以及各種頭頸部軟組織惡性腫瘤,使用順鉑進(jìn)行化療的患者中約75%~100%會發(fā)生不同程度的聽力損失[1]。關(guān)于順鉑耳毒性的臨床報(bào)告和動物實(shí)驗(yàn)研究已有大量報(bào)道[1,2],但都是在體實(shí)驗(yàn)觀察順鉑作用后實(shí)驗(yàn)動物的聽覺電生理改變。研究順鉑在內(nèi)耳的作用靶點(diǎn),對于離體培養(yǎng)條件下順鉑對小鼠耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞的損傷情況尚不清楚。本研究選用新生C57小鼠耳蝸,在離體條件下使用不同濃度順鉑培養(yǎng)液對其基底膜組織進(jìn)行培養(yǎng),觀察順鉑對離體耳蝸毛細(xì)胞的損害作用及特點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組 取出生3~4天的C57小鼠耳蝸40只(由上海中科院動物房提供),以無血清培養(yǎng)液中所含順鉑的不同濃度分組,其中順鉑濃度分別為0、10、50、100μmol/L組各7只耳蝸,400和 1 000μmol/L組各6只耳蝸。0μmol/L組為對照組,其余各組為實(shí)驗(yàn)組。

    1.2 培養(yǎng)用液的配制

    1.2.1 膠原凝膠(Collagen Gel):A:鼠尾膠(Rat tail collagen,每0.02 N乙酸中含3.76 mg/ml,BD-354236);B:2%碳酸鈉(sodium carbonate);C:10×無血清培養(yǎng)液(basal medium eagle,sigma-B9638)。每次培養(yǎng)前按照A:B:C=9:1:1的比例混合均勻滴加于直徑35 mm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi),室溫下超凈臺內(nèi)靜置20分鐘左右,加入適量無血清培養(yǎng)液,置37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱備用。

    1.2.2 無血清培養(yǎng)液(Serum-Free Medium) 每 200 ml中含有2 g小牛血清白蛋白(BSA,sigma A9647)、2 ml無血清添加劑(Serum-free supplement I1884)、4.8 ml 20%葡萄糖(sigma G7021配制)、0.4 ml青霉素G(sigma P3032-10Mu)、2 ml 200 mmol/L L-谷氨酰胺(sigma G6392)和190.8 ml 1×BME(sigma I1552)。

    1.2.3 2 mmol/L順鉑儲存液 培養(yǎng)前使用無血清培養(yǎng)液新鮮配制。

    1.3 耳蝸基底膜取材 使用75%的酒精噴灑動物的頭部及全身進(jìn)行消毒,斷頭后剪開頂骨,體視顯微鏡下(×10)去除腦組織暴露顱底。尖鑷小心分離聽泡周圍軟組織后,完整取下聽泡浸入Hanks液中。由蝸孔小心打開聽泡清除骨性結(jié)構(gòu),用游絲鑷去除耳蝸螺旋韌帶,緊貼骨螺旋板將基底膜完整分離后,平鋪于準(zhǔn)備好的膠原凝膠表面,置37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。

    1.4 培養(yǎng)及給藥 基底膜培養(yǎng)6~8 h后更換含順鉑濃度分別為0、10、50、100、400、1 000μmol/L的無血清培養(yǎng)液(各為2 ml),繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后終止。

    1.5 毛細(xì)胞染色 培養(yǎng)終止后基底膜用10%福爾馬林溶液固定過夜(4℃冰箱),染色前使用0.01 mol/L PBS充分漂洗,基底膜及凝膠一同置25 ng/ml TRITC-Phalloidin溶液中(使用蒸餾水按1:200比例稀釋原液后4℃保存,可反復(fù)使用)避光染色20~30分鐘。再次充分漂洗后,置100 ng/ml DAPI染液中(臨用前使用0.01 mol/L PBS按1:1000比例稀釋DAPI儲存液)避光復(fù)染10~15分鐘,PBS漂洗后制作玻片,避光-20℃冰箱保存。

    1.6 標(biāo)本觀察及結(jié)果分析 采用Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡在激發(fā)光540/25 nm發(fā)射光565 nm波長下觀察染色的基底膜標(biāo)本并計(jì)數(shù)攝片。以0.24 mm為一個(gè)視野從頂回至底回進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù),Phalloidin染色陽性的紅色熒光存在則認(rèn)為毛細(xì)胞仍然存活,計(jì)為一個(gè)細(xì)胞。計(jì)數(shù)結(jié)果輸入電腦采用LS軟件進(jìn)行分析,將全基底膜分為10段繪制毛細(xì)胞缺失圖。毛細(xì)胞圖中曲線顯示的是將全基底膜分為10段后,從距離蝸尖總長度的10%開始至底回鉤端(100%)(X軸)內(nèi)、外毛細(xì)胞數(shù)與正常C57小鼠內(nèi)、外毛細(xì)胞數(shù)相比的缺失百分比(Y軸)。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果輸入LS軟件分析并繪制毛細(xì)胞缺失圖,導(dǎo)出缺失百分比數(shù)據(jù),使用SASS8.0軟件進(jìn)行直線回歸分析。

    2 結(jié)果

    2.1 順鉑致耳蝸毛細(xì)胞缺失的特點(diǎn) 對照組耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞及支持細(xì)胞排列整齊,纖毛及表皮板輪廓清晰,基底膜外周新生上皮細(xì)胞生長良好,DAPI復(fù)染可見細(xì)胞核內(nèi)散在且清晰的染色質(zhì)顆粒(圖1)。

    隨順鉑濃度從10μmol/L到100μmol/L增高,實(shí)驗(yàn)組基底膜耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,毛細(xì)胞排列變得紊亂,纖毛及表皮板形態(tài)發(fā)生改變,支持細(xì)胞形態(tài)破壞,外周新生上皮細(xì)胞逐漸減少。當(dāng)順鉑濃度進(jìn)一步增高至400μmol/L和1 000 μmol/L時(shí),細(xì)胞排列重新變得較為整齊,缺失也明顯減少(圖2)。實(shí)驗(yàn)組DAPI染色可見毛細(xì)胞及支持細(xì)胞缺失區(qū)域細(xì)胞核濃縮(圖3、4)。

    2.2 毛細(xì)胞缺失程度及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 隨著順鉑濃度的增加(10~100μmol/L),距離蝸尖30%~80%段基底膜處(機(jī)械損傷因素基本沒有)平均毛細(xì)胞缺失率從14.5%上升到78.4%,隨著順鉑濃度進(jìn)一步增大至400μmol/L,毛細(xì)胞缺失率降低至48.8%,至1 000μmol/L條件下,細(xì)胞缺失率進(jìn)一步降低為8.77%;對照組的毛細(xì)胞缺失率為0.67%。直線回歸分析結(jié)果顯示在順鉑濃度0~100μmol/L范圍內(nèi),全部10個(gè)節(jié)段基底膜的毛細(xì)胞缺失率與順鉑濃度(對數(shù)值)均呈直線正相關(guān),相關(guān)系數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果(P均小于0.0001)。在順鉑濃度400~1 000μmol/L范圍內(nèi),全部10段基底膜的毛細(xì)胞缺失率與順鉑濃度(對數(shù)值)呈直線負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)t檢驗(yàn)結(jié)果P值70%在α=0.05水平有統(tǒng)計(jì)計(jì)學(xué)意義(圖5,表1)。由圖5可見從頂回至底回,在順鉑作用下,毛細(xì)胞呈基本均勻的缺失,并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。培養(yǎng)前期過程中(加藥之前)為了防止基底膜漂浮而控制培養(yǎng)液用量,頂回靠近蝸尖部位的毛細(xì)胞更接近液體表面,或接觸液體量很少,故而損失略重。

    圖1 對照組耳蝸基底膜(×40)

    圖2 各組動物耳蝸基底膜(×40)

    圖3 對照組、順鉑濃度為100及1 000μmol/L培養(yǎng)條件下小鼠耳蝸基底膜DAPI染色圖像

    圖4 對照組、順鉑濃度為100及1 000μmol/LDAPI染色圖片

    圖5 各組的毛細(xì)胞缺失圖

    表1 耳蝸基底膜各段毛細(xì)胞缺失程度與順鉑濃度關(guān)系統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    3 討論

    本研究采用離體培養(yǎng)方法,觀察不同濃度的順鉑對耳蝸毛細(xì)胞的損傷特點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在離體培養(yǎng)條件下順鉑對耳蝸毛細(xì)胞的損傷在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性,超過一定損傷劑量后細(xì)胞缺失逐漸減少;順鉑對耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞及支持細(xì)胞的損傷沒有特異性,內(nèi)、外毛細(xì)胞的缺損從底回至頂回呈現(xiàn)均一性。

    以往的研究發(fā)現(xiàn)慶大霉素等氨基糖苷類抗生素對耳蝸的損傷呈現(xiàn)劑量依賴性[3]。與氨基糖苷類抗生素所致耳蝸毛細(xì)胞損傷不同,本研究發(fā)現(xiàn)順鉑對毛細(xì)胞的損害并不隨順鉑濃度的升高持續(xù)增大,在低濃度時(shí),隨著順鉑濃度的升高損傷逐漸增大,但當(dāng)順鉑濃度進(jìn)一步增高至400、1 000μmol/L時(shí),毛細(xì)胞損害減輕。導(dǎo)致這種毛細(xì)胞特征性損害的原因可能與順鉑進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)。有研究表明,順鉑進(jìn)入細(xì)胞及核內(nèi)是通過包括CTR1、ATP7A和ATP7B等銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)的[4,5],其轉(zhuǎn)運(yùn)及排出與銅離子存在競爭抑制的關(guān)系,且進(jìn)入細(xì)胞的速度較銅慢很多[4]。另外,Holzer等[6]對卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),使用0.5μmol/L順鉑作用5分鐘即能觸發(fā)包括內(nèi)源性及外生型人hCTR1的表達(dá)水平減少,順鉑濃度為2μmol/L時(shí)hCTR1表達(dá)幾乎完全消失,從而使得銅攝取減少和卵巢癌細(xì)胞耐藥性增加,提示可能隨著順鉑濃度的增加,細(xì)胞膜上銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CTR1表達(dá)減少,從而使得高濃度順鉑條件下細(xì)胞對順鉑的攝取減少而致?lián)p傷減輕。

    氨基糖苷類抗生素對毛細(xì)胞的損傷表現(xiàn)為隨劑量增大而從底回向頂回逐漸進(jìn)展[3],而本研究中,順鉑引起毛細(xì)胞的缺失程度從底回至頂回大致均勻,內(nèi)外毛細(xì)胞損傷基本同步,且對毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的損害沒有選擇性。在低濃度時(shí)(如10μmol/L,相當(dāng)于3 mg/l)可見內(nèi)、外毛細(xì)胞大致相同程度的缺失,當(dāng)順鉑濃度增大到100μmol/L時(shí),內(nèi)、外毛細(xì)胞連同支持細(xì)胞及周邊上皮細(xì)胞幾乎損失殆盡,提示,在離體情況下內(nèi)、外毛細(xì)胞對于順鉑的抵抗力可能無差別。van Ruijven等[7]的在體實(shí)驗(yàn)中使用2 mg/kg-1·d-1順鉑連續(xù)作用4~8天后,發(fā)現(xiàn)順鉑對Corti器的損傷主要發(fā)生在外毛細(xì)胞,與本研究的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有不同。這種離體和在體研究結(jié)果的差異可能與順鉑濃度以及作用方式不同有關(guān),也可能與內(nèi)、外毛細(xì)胞上銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)也有一定的關(guān)系,這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

    此外,與Alam等[8]使用Hoechst 33432觀察到順鉑作用以后耳蝸細(xì)胞的改變相同,本研究在內(nèi)、外毛細(xì)胞纖毛缺失的區(qū)域可以看到DAPI著色的大量濃縮細(xì)胞核,證實(shí)了順鉑對耳蝸組織的損害是通過誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生而產(chǎn)生的。

    綜上所述,順鉑會導(dǎo)致內(nèi)耳Corti器的損傷,這一損傷的發(fā)生是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的;順鉑所致耳蝸細(xì)胞的損傷在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性,超過一定損傷劑量后損害反而減輕,提示在研究順鉑離體損傷和保護(hù)機(jī)制的過程中,選擇培養(yǎng)液時(shí),順鉑濃度不宜過高。

    1 Rybak LP,Whitworth CA,Mukherjea D,et al.Mechanisms of cisplatin-induced ototoxicity and prevention[J].Hear Res,2007,226:157.

    2 van Ruijven MW,de Groot JC,Smoorenburg GF.Time sequence of degeneration pattern in the guinea pig cochlea during cisplatin administration.A quantitative histological study[J].Hear Res,2004,197:44.

    3 Cheng AG,Cunningham LL,Rubel EW.Mechanisms of hair cell death and protection[J].Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg,2005,13:343.

    4 Lutsenko S,Petris MJ.Function and regulation of the mammalian copper-transporting ATPases:insights from biochemical and cell biological approaches[J].J Membr Biol,2003,191:1.

    5 Safaei R.Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs[J].Cancer Lett,2006,234:34.6 Holzer AK,Katano K,Klomp LW,et al.Cisplatin rapidly down-regulates its own influx transporter hCTR1 in cultured human ovarian carcinoma cells[J].Clin Cancer Res,2004,10:6744.

    7 van Ruijven MW,de Groot JC,Klis SF,et al.The cochlear targets of cisplatin:an electrophysiological and morphological time-sequence study[J].Hear Res,2005,205:241.

    8 Alam SA,Ikeda K,Oshima T,et al.Cisplatin-induced apoptotic cell death in Mongolian gerbil cochlea[J].Hear Res,2000,141:28.

    (2009-11-17收稿)

    (本文編輯 周濤)

    CispIatin-Induced Damage of C57 Mice Hair CeIIs in CochIear OrganizationaI CuItures

    Zeng Shan,Yu Dongzhen,Chen Zhengnong,Chen Bin
    (Department of OtoIaryngoIogy,AffiIiated No.6 PeopIe’s HospitaI,Shanghai Jiaotong University,Shanghai,200233,China)

    Objective To investigate the characteristic of the cisplatin-induced damage of hair cells in cochlear organotypic cultures.Methods Three to four-day-old(P3~4)C57 mice were used for this study.The cochlear basilar membrane was cultured for 6~8 hours and then treated with different doses of cisplatin(0μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,400μmol/L,1000μmol/L,7 cochlears for 0-100μmol/L group,6 cochlears for the rest dosage,control group used the dose of 0μmol/L)for 48 hours.TRITC-phalloidin and DAPI were used for stain.The entire cochlear hair cells were observed and counted under Nicon fluorescent microscope.Data was analyzed by LS for hair cells loss graph and SAS 8.0 for linear regression analysis.ResuIts Hair cells loss had rarely been seen in the control group of cochlear tissue under the culture condition.How ever,in cisplatin treated groups,the hair cells loss increased from 14.5%to 78.4%with the concentration of cisplatin increased in the range of 10μmol/L-100μmol/L,while decreased from 48.8%down to 8.77%with the dose getting further higher to 400μmol/L and 1000μmol/L.Apoptosis was confirmed by the DAPI stain in the hair cells loss area.The hair cell loss shows no difference from the apex to the basal turn of the basilar membrane.ConcIusion Cisplatin-induced hair cell death shows characteristic damage that it is dose-dependent in a certain range of dosage,and it decreases when the cisplatin dose higher than the one caus maximal damage under the condition of cochlear organotypic cutures.Apoptosis happens evenly in inner and outer hair cells in all turns of basilar membrane.

    Auditory hair cell; Cochlea; Organizational cultures; Cisplatin

    R764.5

    A

    1006-7299(2010)04-0367-05

    1 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院耳鼻咽喉科,上海交通大學(xué)耳鼻咽喉科研究所,上海交通大學(xué)眩暈疾病診治中心(上海 200233)

    曾珊,女,湖南人,醫(yī)學(xué)碩士在讀,研究方向:耳聾的基礎(chǔ)研究。

    陳斌(Email:binchendoc@126.com)

    10.3969/j.issn.1006-7299.2010.04.016

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