VEGF、bFGF低頻超聲透皮給藥系統(tǒng)對(duì)豬超長(zhǎng)筋膜皮瓣存活的影響

呂 川 陶 然 張敬德 宋建星 王曉云 楊 超

VEGF、bFGF低頻超聲透皮給藥系統(tǒng)對(duì)豬超長(zhǎng)筋膜皮瓣存活的影響

呂 川 陶 然 張敬德 宋建星 王曉云 楊 超

目的應(yīng)用VEGF和bFGF，以透皮低頻超聲導(dǎo)入的無(wú)創(chuàng)給藥方法，比較單一藥物和聯(lián)合用藥對(duì)豬超長(zhǎng)寬比例筋膜皮瓣成活率及其微循環(huán)的影響，為擴(kuò)大超長(zhǎng)寬比例筋膜皮瓣的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法選用10只豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在豬背部?jī)蓚?cè)設(shè)計(jì)3 cm×15 cm的筋膜皮瓣，分為空白超聲對(duì)照組、超聲導(dǎo)入VEGF組、超聲導(dǎo)入bFGF組、注射VEGF+bFGF聯(lián)用組、超聲導(dǎo)入VEGF＋bFGF聯(lián)用組等5組。術(shù)后10 d，測(cè)量皮瓣成活面積，測(cè)定毛細(xì)血管密度以及表達(dá)指數(shù)，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果超聲導(dǎo)入VEGF＋bFGF聯(lián)用組皮瓣成活率、毛細(xì)血管密度及表達(dá)指數(shù)等，均明顯優(yōu)于其他4組，差異有顯著性（P＜0.01）。結(jié)論VEGF和bFGF經(jīng)皮聯(lián)合低頻超聲介導(dǎo)給藥應(yīng)用于豬超長(zhǎng)寬比例筋膜皮瓣，可顯著提高皮瓣的成活率。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子堿性成纖維生長(zhǎng)因子低頻超聲經(jīng)皮給藥超長(zhǎng)皮瓣筋膜皮瓣

臨床上，組織缺損創(chuàng)面極其常見(jiàn)，早期進(jìn)行良好的組織覆蓋是修復(fù)缺損創(chuàng)面的重要條件。筋膜皮瓣，是最常用的一種修復(fù)方法，但由于其血供特點(diǎn)，長(zhǎng)寬比例通常不能超過(guò)3∶1，限制了其在臨床的應(yīng)用。提高超長(zhǎng)寬比例筋膜皮瓣的成活率可以提高其在臨床的應(yīng)用。本研究采用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），借助低頻超聲透皮導(dǎo)入系統(tǒng)的無(wú)創(chuàng)給藥方法，應(yīng)用于超長(zhǎng)寬比例的筋膜皮瓣，觀察皮瓣的成活率及其微循環(huán)的變化，以擴(kuò)大超長(zhǎng)寬比例筋膜皮瓣在臨床的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

選用10只豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。在背部?jī)蓚?cè)對(duì)稱設(shè)計(jì)3 cm×15 cm的筋膜皮瓣，方向與軀干縱軸垂直，每側(cè)分成5組：A組為空白超聲對(duì)照組，予低頻超聲處理；B組為低頻超聲經(jīng)皮導(dǎo)入VEGF組；C組為低頻超聲經(jīng)皮導(dǎo)入bFGF組；D組注射VEGF＋bFGF，于缺血部位多點(diǎn)注射，3次/日；E組以低頻超聲經(jīng)皮導(dǎo)入VEGF＋bFGF。低頻超聲使用功率為20 kHz/3 W·cm2，每次15 min，3次/日。自手術(shù)之日起各組按設(shè)計(jì)連續(xù)處理5 d。術(shù)后每日觀察皮瓣顏色、質(zhì)地、溫度、術(shù)后腫脹情況等。術(shù)后10 d觀察皮瓣成活情況。

1.2 主要試劑和儀器

重組人VEGF165和重組人bFGF（PEPROTECH公司，美國(guó)）。低頻超聲導(dǎo)入儀BM-628型，MIQAS醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)，Leica DMRXA2研究型全自動(dòng)顯微鏡，OLYMPUS BH2生物顯微鏡。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 皮瓣存活面積及成活率

術(shù)后10 d取材，發(fā)黑干燥區(qū)域?yàn)閴乃绤^(qū)域。用透明硫酸紙準(zhǔn)確描繪各組皮瓣形態(tài)，壞死區(qū)域涂黑。利用CMIAS-2001A真彩色圖像分析系統(tǒng)計(jì)算透明紙上染黑區(qū)與未染黑區(qū)的灰度值，精確測(cè)量皮瓣的成活面積與總面積，并計(jì)算成活率。

1.3.2 毛細(xì)血管密度測(cè)定

切取組織標(biāo)本，按照近、中、遠(yuǎn)各1/3等分為3份，每塊組織再分為4等份，各切片1張行HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。在100倍光鏡下每張切片隨機(jī)選擇12個(gè)視野進(jìn)行毛細(xì)血管計(jì)數(shù)，計(jì)算出組織中毛細(xì)血管的密度（個(gè)/cm2），統(tǒng)計(jì)分析中端和遠(yuǎn)端1/3的密度。

1.3.3 人抗VEGF和人抗bFGF免疫組化熒光染色

每條皮瓣中點(diǎn)處取材，制成石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片2張，1張行人抗VEGF染色，另1張行人抗bFGF染色。染色后每張切片均在生物顯微鏡下拍照，對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行定量分析，測(cè)定標(biāo)本陽(yáng)性面積和光密度，計(jì)算出陽(yáng)性指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多樣本方差分析，P＜0.01為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 皮瓣成活率

各組間存在顯著差異，E組皮瓣存活率較其他4組高，且有顯著性差異（P＜0.01）（表1，圖1）。

圖1 各組皮瓣存活情況

2.2 毛細(xì)血管密度測(cè)定

2.2.1 中端1/3毛細(xì)血管密度

E組皮瓣存活率較A組及B、C組高（P＜0.01），但與D組無(wú)差異（P＞0.05）（表2）。

表1 各組皮瓣存活率比較

表2 各組中端1/3毛細(xì)血管密度比較

2.2.2 遠(yuǎn)端1/3毛細(xì)血管密度

A組皮瓣壞死，數(shù)據(jù)缺如。E組皮瓣存活率明顯高于其他3組（P＜0.01）（表3）。

表3 各組遠(yuǎn)端1/3毛細(xì)血管密度比較

2.3 VEGF、bFGF表達(dá)陽(yáng)性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

按α=0.05水準(zhǔn)，E組VEGF、bFGF的表達(dá)均高于其他各組（P＜0.01）（表4、5）。

表4 各組皮瓣VEGF陽(yáng)性指數(shù)比較

表5 各組皮瓣bFGF陽(yáng)性指數(shù)比較

3 討論

超聲透皮給藥，是指超聲可以增強(qiáng)包括大分子藥物在內(nèi)的許多藥物的透皮傳輸。1954年，最早報(bào)道了用超聲成功導(dǎo)人氫化可的松藥膏治療手指關(guān)節(jié)的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎[1]，之后一系列實(shí)驗(yàn)證明超聲對(duì)很多藥物的滲透是有效的[2]，且低頻超聲（f＜100 kHz）提高皮膚通透性的效果最佳[3]。當(dāng)?shù)皖l超聲用于透皮給藥時(shí)，空化作用是其最主要的機(jī)制[4]。它具有其他給藥方式不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：①在皮瓣局部存在血運(yùn)障礙時(shí)，靜脈或口服等全身給藥方法使藥物很難隨血液流動(dòng)到達(dá)缺血部位；透皮給藥將藥物直接作用于缺血部位，可使局部迅速達(dá)到有效血藥濃度。②適用藥物較廣，不限于小分子藥物或水溶物質(zhì)等，大分子蛋白如胰島素、VEGF等亦可使用。③可使藥物在全身或局部長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生較恒定的血藥濃度，且可調(diào)控，從而優(yōu)化藥效，減輕不良反應(yīng)。④與注射給藥和靜脈給藥相比，可避免長(zhǎng)期反復(fù)注射帶來(lái)的疼痛，還可避免局部或血路感染的潛在危險(xiǎn)。⑤與口服給藥相比，大分子蛋白類藥物避免了胃腸道降解的過(guò)程，大大提高了生物效價(jià)。⑥應(yīng)用安全，超聲停止后皮膚屏障功能即可迅速恢復(fù)。

VEGF的主要生物學(xué)功能是促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，具有刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、發(fā)芽作用，還具有增強(qiáng)血管通透性的作用[5]。bFGF是目前已知最強(qiáng)的促細(xì)胞生成因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞萌芽、增殖，增加血管通透性[6-7]。兩者聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)在于VEGF和bFGF都是血小板相關(guān)生長(zhǎng)因子，它們共同維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的成活和增殖[8-9]，可以協(xié)同地促血管生成，使促血管作用更強(qiáng)，并形成差異性互補(bǔ)，使缺血區(qū)快速血管化，以達(dá)到臨床治療的目的[10－12]。用兩者共同刺激體外培養(yǎng)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在同樣的條件下，其細(xì)胞數(shù)目要比單獨(dú)用任何一種時(shí)多2～8倍[13]。Ley等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)bFGF與VEGF劑量在3∶1時(shí)所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)最強(qiáng)。本研究證實(shí)，同等效價(jià)的兩種藥物經(jīng)低頻超聲聯(lián)合應(yīng)用，較之于單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合注射給藥，能夠更加有效地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而增大皮瓣成活面積、擴(kuò)大筋膜皮瓣的長(zhǎng)寬比例。另外，在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)給藥系統(tǒng)，僅在局部小劑量應(yīng)用，安全性較高；可以較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)給藥，避免因藥物的半衰期過(guò)短而導(dǎo)致的血藥濃度無(wú)法維持。

目前，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)低頻超聲經(jīng)皮給藥具有良好的安全性和有效性，然而各類動(dòng)物皮膚的通透性、屏障作用以及對(duì)超聲產(chǎn)生的能量耐受敏感度與人類皮膚均存在差異，需進(jìn)一步研究以確定不同藥物的最佳使用頻率。另外，低頻超聲經(jīng)皮給藥系統(tǒng)仍需基礎(chǔ)、臨床和醫(yī)用工程學(xué)三者的緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)儀器的專門化、實(shí)用化、微型化，以利于超聲透皮給藥的臨床推廣和應(yīng)用。我們相信，本方法的日趨成熟，將使超長(zhǎng)寬比例筋膜皮瓣的臨床應(yīng)用范圍更加廣泛，為各種組織缺損的修復(fù)提供更加簡(jiǎn)單、有效的解決途徑。

[1]楊云松,彭紅云,章國(guó)林,等.透皮控釋給藥研究[J].高分子通報(bào). 2002,1:49-56.

[2]Mitragotri S,Kost J.Low-frequency sonophoresis:a review[J]. Advaneed Drug Delivery Reviews,2004,56(5):589-601.

[3]Boucaud A,Garrigue MA,Machet L,et a1.Effect of sonication parameters on transdermal delivery of insulin to hairless rats[J]. J Control Release,2002,81(1-2):113-119.

[4]屠熙,尹芹芹,張文勝,等.低頻超聲透皮給藥的研究進(jìn)展與應(yīng)用[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2008,25(6):1474-1478.

[5]何艷,曹以誠(chéng).VEGF與腫瘤血管生成及其在抗腫瘤藥物開發(fā)中的應(yīng)用[J].生命科學(xué),2008,2:222-224.

[6]Duffy FJ Jr,Maitz PK,Hergrueter CA,et al.Maximizing flap survival in a prefabrication model using exogenous and endogenous bFGF: a new approach[J].Microsurgery,1996,17(4):176-179.

[7]Fujihara Y,Koyama H,Ohba M,et al.Controlled delivery of bFGF to recipient bed enhances the vascularization and viability of an ischemic skin flap[J].Wound Repair Regen,2008,16(1):125-131.

[8]Wakisaka N,Pagano JS.Epstein-Barr virus induces invasion and metastasis factors[J].Anticancer Res,2003,23:2133-2138.

[9]Eriksson K,Magnusson P,Dixelius J,et a1.Angiostatin and endostatin inhibit endothelial cell migration in response to FGF and VEGF without interfering with specific intracellular signal transduction pathways[J].FEBS Len,2003,536:19-24.

[10]Lang I,Hoffmann C,Olip H,et a1.Differential mitogenic responses of human macrovascular and microvascular endothelial cells to cytokines underline their phenotypic heterogeneity[J].Cell Prolif, 2001,34:143-155.

[11]Tille JC,Pepper MS.Mesenchymal cells potentiate vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in vitro[J].Exp Cell Res,2002, 280:179-191.

[12]Trivier E,Kurz DJ,Hong Y,et al.Differential regulation of telomerase in endothelial cells by fibroblast growth factor-2 and vascular endothelial growth factor-a:association with replicative life span [J].Ann N Y Acad Sci,2004,1019:111-115.

[13]Pepper MS,Mandriota SJ,Jeltsch M,et a1.Vascular endothelial growth factor(VEGF)-C synergizes with basic fibroblast growth factor and VEGF in the induction of angiogenesis in vitro and alters endothelial cell extracellular proteolytic activity[J].J Cell Physiol, 1998,177:439-452.

[14]Seghezzi G,Patel S,Ren CJ,et a1.Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)induces vascular expression in the endothelial cell of forming capillaries:an autocrine mechanism contributing to angiogenesis [J].J Cell Biol,1998,14l:1659-1673.

The Application of VEGF and bFGF Via Low-Frequency Ultrasound-Mediated Transdermal Drug Transport System in the Improvement of Maximizing Survival of Fascio-Cutaneous flap with Super Length Ratio in Pigs

LU Chuan,TAO Ran,ZHANG Jingde,SONG Jianxing,WANG Xiaoyun,YANG Chao.Corresponding author:YANG Chao. Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital Affiliated the Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.

PurposeTo explore the effects of single or combined application of VEGF and bFGF via the noninvasive medication of ultrasound-mediated transdermal drug transport(UMTDT)in the survival rate and microcirculation of fasciocutaneous flap with big ratio of length to width.MethodsA total of 100 fascio-cutaneous flaps were performed on the sides of the back in ten pigs.The flap area ranged from 3 cm×15 cm.These flaps were randomly divided into 5 groups as follows. A:control group with blank ultrasound;B:VEGF by low-frequency UMTDT;C:bFGF by low-frequency UMTDT;D:VEGF and bFGF by localized injection in multiple points;E:VEGF and bFGF by low-frequency UMTDT.The quantitative analysis of the vitality of the flaps,capillary intensity and expression index were observed 10 days after operation.ResultsThere was significant difference between the group of combined medication of both and bFGF via UMTDT and the other four groups in flap survival rate,capillary intensity and expression index.ConclusionThe combined medication of VEGF and bFGF via UMTDT can significantly enhance the survival rate of fascio-cutaneous flaps with big ratio of length to width.

Vascular endothelial growth factor(VEGF);Basic fibroblast growth factor(bFGF);Low-frequency ultrasound; Transdermal drug delivery;Super long flap;Fascio-cutaneous flap

R622+.9

A

1673－0364（2010）01－0021－03

2009年12月29日；

2010年1月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.006

200433上海市上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院整形外科。

楊超。