草珊瑚總黃酮的微波提取研究

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(三明學(xué)院化學(xué)與生物工程系，福建 三明 365004)

草珊瑚(Sarcandraeglabra)又名腫節(jié)風(fēng)、九節(jié)茶、竹節(jié)草、鴨腳節(jié)、牛膝頭等，屬于金粟蘭科草珊瑚屬，其味苦、辛、性溫、有小毒，有驅(qū)風(fēng)通絡(luò)、活血祛淤、止血止痛、接骨續(xù)筋之功效，民間常用來(lái)治療風(fēng)濕痹癥、跌打損傷等[1～4]，多為全草入藥。臨床上草珊瑚主要用于治療腫瘤、胃潰瘍、細(xì)菌性痢疾、骨折及各種口腔疾病。草珊瑚主要分布在四川、云南、貴州、安徽、福建、江西等地，資源豐富。草珊瑚中含量最多、最主要的藥用成分是黃酮類(lèi)化合物[4～9]。草珊瑚總黃酮具有抗菌消炎、清熱解毒、抗腫瘤、促進(jìn)骨折愈合等多種生物活性[6～10]。毒理學(xué)研究表明，草珊瑚及其提取物具有較好的安全性[11]。因此，近年來(lái)，草珊瑚活性成分的高效提取一直是國(guó)內(nèi)外研究的重要課題。

目前，黃酮類(lèi)化合物的常規(guī)提取方法主要有冷浸法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、稀醇提取法和微波法。其中微波法具有選擇性高、操作時(shí)間短、溶劑消耗少、提取率高、不產(chǎn)生噪音等優(yōu)點(diǎn)，適用于熱不穩(wěn)定生物質(zhì)藥材的提取[12～31]。

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)三明地區(qū)基因工程選育的草珊瑚總黃酮進(jìn)行提取,得出最佳的工藝條件，擬為三明地區(qū)基因工程選育的草珊瑚的開(kāi)發(fā)利用提供有益的參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 原料、試劑與儀器

草珊瑚葉片采自福建三明市吉口天然藥物種植基地。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸，分析純；甲醇，色譜純；水為超純水。

LWMC-205型可調(diào)功率微波化學(xué)反應(yīng)器，南京陵江科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)、FA1604N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；800型離心沉淀器(4000 r·min-1)，上海手術(shù)器械廠；360型FTIR紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；1200型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1．2 方法

1.2.1 草珊瑚總黃酮的提取

精確稱(chēng)取0.5 g草珊瑚葉片粉末(過(guò)120目篩)于錐形瓶中，加入一定量不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇搖勻，將瓶口用保鮮膜覆蓋，浸泡1 h，在一定功率下微波提取一定時(shí)間，抽濾，濾液加水定容。

1.2.2 草珊瑚總黃酮的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取10.4 mg已烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為0.104 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為510 nm。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加60%乙醇至5 mL；各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再各加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；最后各加4%氫氧化鈉溶液4 mL，并用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min；在510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度(x)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。擬合線性回歸方程為：y=1.6894×10-4+0.013175x；R=0.9999。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2.3 樣品含量的測(cè)定

精密吸取提取液1 mL，置于10 mL容量瓶中,按1.2.2.2方法測(cè)定吸光度。總黃酮提取率依下式計(jì)算：

1.3 表征

1.3.1 紅外光譜分析

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和草珊瑚總黃酮提取物適量，制樣，測(cè)定紅外光譜。

1.3.2 顯色反應(yīng)

(1)三氯化鐵反應(yīng):取1 mL提取液于試管中,加1%三氯化鐵乙醇溶液數(shù)滴,振蕩,觀察顏色變化。

(2)三氯化鋁反應(yīng):取提取液點(diǎn)在濾紙上,吹干,滴加1%三氯化鋁乙醇溶液,再吹干,觀察顏色變化。

(3)氫氧化鈉反應(yīng):取1 mL提取液于試管中,加4 mol·L-1氫氧化鈉溶液數(shù)滴,觀察顏色變化,靜置一段時(shí)間，再觀察顏色變化。

(4)濃氨水反應(yīng):取提取液點(diǎn)在濾紙上,吹干,將濾紙?jiān)跐獍彼戏窖?.5 min左右,觀察顏色變化。

1.3.3 高效液相色譜分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.04%磷酸溶液(50∶50,體積比)；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速0.8 mL·min-1;進(jìn)樣量5 μL；柱溫35℃。

1.3.3.2 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1018 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品或0.1018 g草珊瑚總黃酮提取物，用甲醇溶解定容至10 mL，用微量進(jìn)樣器吸取5 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜峰。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

在固液比為1∶20(g∶ mL)、微波功率為320 W的條件下，分別選用30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇浸泡1 h，微波間歇提取3次，每次30 s。考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮提取率上升；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮提取率最高；但乙醇的體積分?jǐn)?shù)再增大時(shí)，總黃酮提取率反而降低。其原因可能與黃酮類(lèi)化合物的極性有關(guān)，提高乙醇體積分?jǐn)?shù)可以增強(qiáng)溶劑對(duì)物料的滲透性，加大黃酮類(lèi)化合物的溶解度。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，提取液中會(huì)帶入色素及脂溶性物質(zhì)，使得提取率降低。另外，微波加熱時(shí)主要是物料中的極性分子尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量的熱量，使物料升溫，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大會(huì)減少料液中水的比例，造成料液升溫減慢，從而影響提取率。

2.1.2 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，其它條件不變，考察微波功率對(duì)草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)微波功率小于400 W時(shí)，總黃酮提取率隨微波功率的增大而增大，這是由于微波功率增大，加熱效果更好，分子運(yùn)動(dòng)加劇，浸出的總黃酮就越多；當(dāng)微波功率超過(guò)400 W后，提取液中總黃酮的含量開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)榇蠊β十a(chǎn)生的強(qiáng)熱效應(yīng)對(duì)提取率造成了影響。

2.1.3 固液比對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，其它條件不變，考察固液比對(duì)草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 固液比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖4可知，草珊瑚總黃酮的提取率隨固液比的減小相應(yīng)提高，但當(dāng)固液比減小到1∶30時(shí)，繼續(xù)增加溶劑的量對(duì)總黃酮提取率影響不大。

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

在固液比為1∶20(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為320 W的條件下，分別選用10 s×3、20 s×3、30 s×3、40 s×3、50 s×3的微波加熱時(shí)間，考察其對(duì)草珊瑚總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 微波加熱時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著微波加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率不斷增大，但超過(guò)30 s×3后提取率開(kāi)始下降。這可能是由于短時(shí)間的微波作用對(duì)細(xì)胞膜的破碎作用較大，浸出的總黃酮較多，提取率上升較快；但長(zhǎng)時(shí)間的微波作用會(huì)使提取液溫度過(guò)高，可能對(duì)總黃酮產(chǎn)生破壞。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、固液比和微波加熱時(shí)間作為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1，結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可以看出，各因素對(duì)微波法提取草珊瑚總黃酮提取率的影響大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波加熱時(shí)間>固液比>微波功率。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮，確定最佳工藝條件為：60%乙醇、固液比1∶40(g∶ mL)、微波功率400 W、微波加熱時(shí)間30 s、間歇加熱3次，此時(shí)草珊瑚葉片中總黃酮的提取率為9.394%。

2.3 微波法提取與傳統(tǒng)乙醇浸提法比較(表3)

表3 微波提取與傳統(tǒng)乙醇浸提法的比較

從表3可以看出，采用微波法提取草珊瑚總黃酮不但提高了提取率，還大幅縮短了提取時(shí)間。

2.4 不同生長(zhǎng)期的草珊瑚總黃酮提取率比較

分別選取1年生、2年生、3年生的草珊瑚葉片在最佳條件下提取總黃酮，其提取率分別為9.390%、7.929%、6.023%，草珊瑚中總黃酮含量隨著草珊瑚生長(zhǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而降低,1年生嫩葉片的含量最高。

2.5 提取物的定性分析

2.5.1 紅外光譜(圖6)

圖6 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)和草珊瑚總黃酮(b)的紅外光譜圖

圖6中，3427.38 cm-1處為-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，峰較強(qiáng)，1619.77 cm-1、1443 cm-1處為苯環(huán)的吸收峰。圖6a和圖6b的特征峰基本相似，說(shuō)明從草珊瑚中提取的總黃酮的成分與蘆丁相似。

2.5.2 顯色反應(yīng)結(jié)果(表4)

表4 顯色反應(yīng)鑒定結(jié)果

2.5.3 高效液相色譜(圖7)

圖7 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(a)和草珊瑚總黃酮(b)的高效液相色譜圖

由圖7可知，草珊瑚樣品中的1#峰與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的1#峰保留時(shí)間基本一致，可推知1#峰為黃酮類(lèi)化合物。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定微波法提取草珊瑚總黃酮的最佳條件如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、固液比1∶40(g∶mL)、微波功率400 W、微波加熱時(shí)間30 s、間歇作用3次，此時(shí)草珊瑚總黃酮的提取率達(dá)到9.394%。

(2)微波法提取與傳統(tǒng)乙醇浸提法相比，省時(shí)、高效、節(jié)能。

(3)草珊瑚中總黃酮含量隨著草珊瑚生長(zhǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而降低,1年生嫩葉片的含量最高。

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