終末糖基化產(chǎn)物、高脂誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用途徑及葛根素的保護(hù)作用*

張 潔，郭茂娟，薛 亮，范英昌

細(xì)胞凋亡進(jìn)程中重要的執(zhí)行者和與細(xì)胞凋亡進(jìn)程密切相關(guān)的線(xiàn)粒體屬于細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)范疇。Caspase家族作為特異性的死亡信號(hào)傳導(dǎo)分子是凋亡的執(zhí)行者，Caspase-3作為凋亡級(jí)聯(lián)中的效應(yīng)因子被稱(chēng)為“殺手蛋白”。如果高糖高脂促進(jìn)凋亡，則進(jìn)一步信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變以明確凋亡的機(jī)制[1]。本實(shí)驗(yàn)探討葛根素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，研究葛根素在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展中的多靶點(diǎn)調(diào)控作用[2-3]。首先通過(guò)終末糖基化產(chǎn)物（AGE）和氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）干預(yù)離體培養(yǎng)胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，從內(nèi)皮細(xì)胞凋亡剝脫入手，離體探討糖尿病與斑塊糜爛的相關(guān)性，明晰斑塊糜爛的發(fā)病機(jī)制；其次選擇有效保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的中藥葛根素作為研究對(duì)象，觀察其穩(wěn)定斑塊的作用及相應(yīng)機(jī)制，為合并高糖的動(dòng)脈粥樣硬化患者防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開(kāi)拓穩(wěn)定斑塊的新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 葛根素由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所提供，AGES購(gòu)自博奧森試劑公司，氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）購(gòu)自北京中醫(yī)研究院，DMEM購(gòu)自GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV－304購(gòu)于天津血液病研究所。Caspase3試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司，CD31單克隆抗體（1∶100 Sigma）購(gòu)置天津市聯(lián)星生物制劑有限；流式細(xì)胞分析儀（BD），病理圖像分析系統(tǒng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。無(wú)菌條件下取健康產(chǎn)婦臍帶,用Hanks緩沖液反復(fù)沖洗后,加入1%膠原酶，37℃消化15 min后終止，離心后加入完全培養(yǎng)液DMEM（5%小牛血清，1×105U/L青霉素，1×105U/L鏈霉素),置于 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液，待細(xì)胞80%融合，用胰蛋白酶－EDTA消化傳代，經(jīng)CD31鑒定后，第2~3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 高糖高脂干預(yù)劑量及藥物濃度的確定

1.3.1 高糖濃度確定 用不同濃度（12.5，25，50，100，200 μg/mol）AGE 與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育 24 h，噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)存活細(xì)胞數(shù)，繪制抑制率曲線(xiàn)，以確定最佳濃度，最終確定50 μg/mol為最佳濃度。

1.3.2 高脂濃度確定 用不同濃度（0、25、50、100、200 mg/L)的ox-LDL與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24 h，MTT法測(cè)存活細(xì)胞數(shù)，繪制抑制率曲線(xiàn)，確定最佳濃度，最終確定50 mg/L為最佳濃度。

1.3.3 藥物濃度設(shè)定 根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，葛根素與內(nèi)皮細(xì)胞孵育2 h后加入高糖高脂，共同孵育24 h。MTT法測(cè)存活細(xì)胞數(shù)，繪制抑制率曲線(xiàn)，確定最佳濃度，葛根素的最佳濃度是100 mg/L，洛伐他汀藥濃度為2 g/L，有效濃度為50 μmol/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 1）正常組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，不作任何處理。2）高糖加高脂（AGE+ox-LDL組）：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并用高糖高脂進(jìn)行干預(yù)。3）陽(yáng)性對(duì)照藥組（AGE+ox-LDL組+洛伐他汀組）：在2）基礎(chǔ)上，用洛伐他汀干預(yù)。4）AGE+ox-LDL+葛根素組：在2）基礎(chǔ)上，用葛根素進(jìn)行干預(yù)。

1.5 方法

1.5.1 采用相應(yīng)的活性Caspase3抗體免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) 生長(zhǎng)良好的EVC304經(jīng)消化后，接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞長(zhǎng)致八成滿(mǎn)。在處理因素作用48 h后，取出附有內(nèi)皮細(xì)胞的蓋玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，0.4 g/L多聚甲醛固定，按SABC免疫酶標(biāo)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）方法進(jìn)行。每張片子按照從上倒下，從左到有順序選取8個(gè)視野，計(jì)數(shù)Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求得平均值作為該張片子的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)凋亡細(xì)胞率 實(shí)驗(yàn)用六孔培養(yǎng)板,1×106/孔,收集各組細(xì)胞加入羅丹明123染液 5 mg/L，37℃，5%二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10 min，離心以培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次，重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)60 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)488～505nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～575 nm（一般為530nm）；MedFitLT3.0軟件分析細(xì)胞凋亡百分率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，經(jīng)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，則采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞FITC標(biāo)記CD31×200

2 結(jié)果

2.1 CD31鑒定內(nèi)皮細(xì)胞 見(jiàn)圖1。

培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31FITC標(biāo)記的免疫熒光，在熒光顯微鏡下觀察：胞漿染色顯示綠色，中間的核不著色，證實(shí)為內(nèi)皮細(xì)胞。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Caspase3凋亡細(xì)胞數(shù) 葛根素處理人臍靜脈EVC304 48 h，Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組明顯降低，內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。見(jiàn)表1。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡百分比 與正常組相比,高糖高脂培36 h后明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率,而葛根素預(yù)處理12 h后加入高糖作用36 h,凋亡率明顯下降。見(jiàn)表2。

表1 各組細(xì)胞Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（s）個(gè)

表1 各組細(xì)胞Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（s）個(gè)

注：與正常組比較，aP<0.01；與 AGES ＋OX－LDL 組比，bP＜0.05，AGES＋OX－LDL＋洛組與 AGES＋OX－LDL＋葛組相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 P＞0.05。

組別正常組AGES+OX-LDL AGES+OX-LDL+洛AGES+OX-LDL+葛n8888 caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)3.375±1.59 22.375±9.22a 15.625±4.89b 15.375±4.47

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡百分率（s）%

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡百分率（s）%

注：與正常組比較，aP＜0.01；與 AGES ＋OX－LDL 組比，bP＜0.01，cP＜0.05，與 AGES＋OX－LDL＋洛組比。

組別正常組AGES+OX-LDL AGES+OX-LDL+洛AGES+OX-LDL+葛n8888凋亡率4.46±0.44 6.10±0.36a 2.40±0.12 1.10±0.55c

3 討論

血糖升高是糖尿病大血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素[4]，高糖可以導(dǎo)致多種形式的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，其中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡被認(rèn)為與糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化加重有關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)證明在高糖環(huán)境下葛根素具有抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，并減弱高糖誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活性。細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶和信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控的一個(gè)“瀑布式”激活過(guò)程。近年人們發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)在細(xì)胞凋亡的信息傳遞中具有重要作用的蛋白酶家族Caspase，目前已發(fā)現(xiàn)該家族中有16個(gè)成員，Caspase3則是這一家族的重要成員，它處于細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵地位[6]。Caspase3被激活后可裂解產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量1.7萬(wàn)的活性亞單位，后者可進(jìn)一步激活Caspases活化的核酸內(nèi)切酶（CAD），活化的CAD可切割DNA，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，在多種細(xì)胞的凋亡過(guò)程中均有Caspase3的活性的變化[7-8]。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化的方法，檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示,在凋亡率最高的模型組中，Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最高，正常組Caspase3最低，說(shuō)明Caspase3能夠直接反映細(xì)胞凋亡情況，跟凋亡密切相關(guān)。經(jīng)過(guò)用藥干預(yù)，各治療組Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯下降，細(xì)胞凋亡趨勢(shì)減弱，葛根素與陽(yáng)性對(duì)照組Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P>0.05。說(shuō)明葛根素可通過(guò)抑制Caspase3的表達(dá)，減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)凋亡百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高糖高脂可以誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而且進(jìn)一步證明葛根素預(yù)處理后可以抑制高糖高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,葛根素組和洛伐他汀作為陽(yáng)性對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡均有明顯低于模型組（P<0.05），且葛根素組效果更好，說(shuō)明葛根素能夠抑制高糖高脂環(huán)境下的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

最近研究表明葛根素由于其主要成分異黃酮具有雌激素樣作用，因此又被歸為植物雌激素。植物雌激素可以結(jié)合于雌激素受體發(fā)揮雌激素樣作用，可以預(yù)防某些癌癥的發(fā)生、抗氧化、清除氧自由基、降低血清膽固醇、促進(jìn)細(xì)胞增殖。其對(duì)抗缺血缺氧、氧自由基過(guò)多性?xún)?nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，有利于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能和內(nèi)分泌功能，可以減輕缺血后炎癥反應(yīng)[3]，對(duì)預(yù)防臨床溶栓或血管介入治療中常出現(xiàn)的缺血/再灌注損傷具有積極意義。研究表明，葛根素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，為臨床治療提供了理論依據(jù)。

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