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    三七總皂苷對缺氧復(fù)氧致皮質(zhì)神經(jīng)元損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白表達的影響*

    2010-06-02 07:13:58康立源周志煥柴麗娟高秀梅

    康立源,周志煥,張 萌,柴麗娟,高秀梅,王 怡,郭 紅,閆 晨

    B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)同屬于Bcl-2家族,但卻具有相反的作用,前者可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,后者能夠促進凋亡的發(fā)生。Bcl-2與Bax結(jié)合形成異源二聚體,不顯示各自活性;當(dāng)Bcl-2磷酸化,Bax表達增多或是B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)凋亡(Bad)取代Bax與Bcl-2結(jié)合后,Bax隨即獲釋而形成誘導(dǎo)死亡的同源二聚體,進入線粒體破壞其膜的通透性,將細(xì)胞色素C和凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)釋放至胞漿[1-2]。在三磷酸腺苷(ATP)存在的情況下,細(xì)胞色素C能與Apaf-1形成復(fù)合體,該復(fù)合體可以活化天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9),再激活caspase-3,啟動caspase級聯(lián)反應(yīng),通過特異性地裂解其底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA表達的變化,采用福林-酚法(Lowrry)法檢測caspase-3蛋白含量的變化,探討PNS抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的分子機制。

    1 材料

    1.1 實驗動物 孕17~18 d Wistar大鼠由天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

    1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、B-27(GIBCO,美國);胰酶 1∶250(Ameresco,美國),胎牛血清(HYCLONE,美國);多聚賴氨酸、EDTA(SIGMA,美國);Mouse Anti-MAP2單克隆抗體(CHEMICON,美國)、青霉素、鏈霉素(市售分析純)。TRIzol(invitrogenTM,美國),丙三醇、氯仿、無水乙醇(分析純,天津市化學(xué)試劑廠),DEPC、Folin—酚(鼎國,北京),合成的上、下游引物(上海生工生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 主要儀器 Allegra-64R Centrifuge低溫高速離心機(BECKMAN,美國),DU-530紫外分光光度計(DNA/Protein Analyzer,BECKMAN,美國),ECP3000水平電泳儀(北京六一儀器廠),GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)(Bio Imaging System,SYNGENE,英國),PCR儀ABI誖7300實時熒光定量系統(tǒng)(Applied Biosystems,美國),Biofuge低溫離心機(德國),紫外分光光度計(Backman,美國),熒光分光光度計(島津,日本)。

    2 方法

    2.1 神經(jīng)元細(xì)胞(CNC)缺氧復(fù)氧損傷模型的復(fù)制及分組 參照文獻[3-5],利用三氣培養(yǎng)箱,在94%氮氣(N2)-5%二氧化碳(CO2)-1%氧氣(O2)孵箱內(nèi)缺氧24 h,95%空氣-5%CO2孵箱中復(fù)氧24 h,復(fù)制CNC缺氧復(fù)氧(H/R)損傷模型。分組及各組處理方案如下:1)Control:置換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,不做缺氧復(fù)氧處理。2)H/R組:置換無血清培養(yǎng)液,將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24 h,再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24 h。3)H/R+PNS 50 mg/L組:置換含PNS 50 mg/L無血清培養(yǎng)液,將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24 h,再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24 h。4)H/R+PNS 10 mg/L組:置換含PNS 10 mg/L無血清培養(yǎng)液,將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24 h,再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24 h。5)H/R+PNS 2 mg/L組:置換含PNS 2 mg/L無血清培養(yǎng)液,將培養(yǎng)板放入94%N2-5%CO2-1%O2空氣條件下的三氣培養(yǎng)箱缺氧孵育24h,再于95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧孵育24h。

    2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測缺氧復(fù)氧神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因mRNA的表達

    2.2.1 總RNA的提取與檢測 六孔板棄培養(yǎng)液,冷PBS洗2次,每孔加500 μL裂解液TRIzol,反復(fù)吹打,轉(zhuǎn)移至1.5 mLEppedorf管中。將樣品在室溫放置5 min,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加0.1 mL氯仿,蓋好管蓋,劇烈振蕩15 s,室溫放置15~30 min。4℃12 000 r/min離心15 min,樣品分成3層:紅色的有機相,中間層和無色的水相。把水相轉(zhuǎn)移到新的無RNase的離心管中。緩慢加入1倍體積-20℃保存的丙三醇,混勻,置-20℃2 h以上,充分沉淀RNA。4℃10 000×g離心10 min,棄上清。沉淀加入75%乙醇 1 mL,重新懸浮,4℃ 8 000×γ離心10 min,棄上清液。超凈臺內(nèi),室溫?fù)]發(fā)5 min,加入適量無RNnase水輕輕吹打沉淀,使之溶解,分裝備用。紫外分光光度法檢測RNA樣品的濃度及純度,1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

    2.2.2 引物序列的設(shè)計與合成 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,檢測基因的引物序列如下:Bcl-2:Forward primer:TCTGTGGATGACTGAGT ACCTGAAC;Reverse primer:AGAGACAGCCAGGAG AAATCAAAC。Bax:Forward primer:GGGTGGTTGCC CTTTTCTACT;Reverse primer:CCCGGAGGAAGTCC AGTGTC。caspase-3:Forward primer:AATTCAAGGG ACGGGTCATG;Reverse primer:GCTTGTGCGCGTAC AGTTTC。GAPDH:Forward primer:CCCCCAATGTAT CCGTTGTG;Reverse primer:TAGCCCAGGATGCCCT TTAGT。

    2.2.3 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系:10×Taqman RT buffer,1 μL;RNase free water,2 μL;25 mmol/L 氯 化 鎂(MgCl2)2.2 μL;Dntp mixture,0.5,Rnase inhibitor,0.2 μL;Multistreble Reverse Transprime,0.25;RNase Free H2O,Variable。輕輕混勻,分別按各樣本RNA的含量加入RNA,用 RNase free water補足 10 μL。反轉(zhuǎn)錄條件:25℃ 10 min;48℃ 30 min;95℃ 5 min。

    2.2.4 實時熒光定量RT-PCR實驗方法 使用ABI誖7300實時定量PCR儀,采用相對定量實驗方法。每個指標(biāo)每次實驗反應(yīng)6個不同的樣本,重復(fù)3次。反應(yīng)體系:2× Master Mix 12.5 μL;Forward primer and Reverse primer 0.5 μL;cDNA sample 0.5 μL;RNase Free H2O 11.5。熱循環(huán)條件參數(shù)如下:50℃ 30 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 sec,60 ℃ 1 min,40 cycles。

    2.2.5 數(shù)據(jù)處理 Ct值:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),與拷貝量呈反對數(shù)關(guān)系。應(yīng)用ABI誖7300實時定量PCR儀分析軟件調(diào)整基線和閾值后,查看并分析反應(yīng)板數(shù)據(jù),獲得每個樣品每次反應(yīng)的Ct值,計算得到其△Ct,進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計[6]。△Ct=Ct待測基因-Ct內(nèi)參照基因△△Ct=基因表達=2-△△Ct。

    2.3 缺氧復(fù)氧神經(jīng)元caspase-3活性檢測以及蛋白質(zhì)定量

    2.3.1 缺氧復(fù)氧神經(jīng)元caspase-3活性檢測 取處理好的接種于6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞,每孔加入0.125%胰酶 500 μL,消化 3~5 min,加入 100 μL 胎牛血清終止消化,加入1 mL冷PBS,輕輕吹打,并收集細(xì)胞到離心管中。4℃,800 r/min,離心5 min,輕輕吸去上清,加入3 mL冷磷酸鹽緩沖液(PBS),重新懸浮細(xì)胞,重復(fù)此步驟一次,轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管中,4℃,1 000 r/min,離心 5 min,小心吸去上清液。沉淀加入1×細(xì)胞裂解液,反復(fù)凍溶3次,4℃,500 r/min,離心5 min。取上清,采用Lowrry法測定裂解液中蛋白濃度。取上清液50 μL加入黑色酶標(biāo)板中,加入50 μL底物工作液,同時作空白對照。室溫,避光孵育30 min,熒光分光光度計檢測熒光強度。激發(fā)波長360nm,發(fā)射波長460nm,光敏強度40。

    caspase-3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:取7-氨基-4-甲基香豆素(AMC),制成10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液備用。取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液,稀釋為 0、1、10、20、30、40、50、100 μmol/L 8個濃度,每個濃度做一個復(fù)孔。分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入黑色酶標(biāo)板中,加入50 μL底物工作液。室溫,避光孵育30 min,熒光分光光度計檢測熒光強度。

    2.3.2 缺氧復(fù)氧神經(jīng)元caspase-3蛋白質(zhì)定量 采用Lowrry法測定蛋白含量:反應(yīng)液配制:將1 g碳酸鈉(Na2CO3)溶于 50 mL 0.2 mol/L NaOH 中,0.5 g明礬(CuSO4·5 H2O)溶于100 mL 1%酒石酸鈉溶液中。然后將前者50 mL與后者1 mL混合,備用。將Folin—酚試劑稀釋至1 mol/L,備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:配制25 g/L的牛血清白蛋白貯備液,稀釋至250,200,150,100,50,25,20,10,0 mg/L;取 11 支試管,編號,分別加入不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液1 mL,以去離子水做空白對照,加入5 mL反應(yīng)液,漩渦混勻,室溫孵育30 min,再加入1 mLFolin—酚試劑,混勻,室溫孵育10 min,然后于500 nm處,1 cm光徑比色皿,測定吸光度。樣品測定:取20 μL細(xì)胞裂解上清液,稀釋至1 mL(稀釋50倍),加入5 mL反應(yīng)液,漩渦混勻,室溫孵育30 min,再加入1 mL 1 mol/L的Folin—酚試劑,混勻,室溫孵育10min,然后于500nm處,1 cm光徑比色皿,測定吸光度。

    2.3.3 數(shù)據(jù)處理 1)蛋白含量:制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程和R2值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品蛋白含量,見圖1。

    圖1 蛋白含量曲線圖

    蛋白含量=(樣品吸光度-0.002 6)×50/0.000 5

    2)caspase-3含量:制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程和R2值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算caspase-3含量。

    3)caspase-3-like-activity=[(樣品吸光度-78.426)/28.594]/蛋白含量

    3 結(jié)果

    結(jié)果表明,H/R組Bax表達顯著升高,與control組比較有顯著差異(P<0.05),PNS可以顯著降低Bax表達,50、10 mg/L與H/R組比較有顯著性差異(P<0.05);H/R組Bcl-2表達明顯降低,與control組比較有顯著差異(P<0.05),PNS可以增加Bcl-2表達,50 mg/L與H/R組比較有顯著性差異(P<0.05);H/R組caspase-3表達有升高的趨勢,PNS有降低caspase-3表達的趨勢,但無顯著差異。H/R組caspase-3活性明顯升高,與control比較有顯著性差異(P<0.05),PNS 50、10、2 mg/L各劑量組均能夠抑制caspase-3的活性,有劑量依賴性趨勢。見表1,見表2。

    表1 PNS對缺氧復(fù)氧致CNC損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達的影響(s)

    表1 PNS對缺氧復(fù)氧致CNC損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達的影響(s)

    注:與對照組比較,#P<0.05,與H/R比較,*P<0.05。

    組別對照組H/R H/R+PNS 50 mg/L H/R+PNS 10 mg/L H/R+PNS 2 mg/L caspase-3 0.66±0.08 0.83±0.11 0.73±0.25 0.79±0.24 0.82±0.31 n66666 Bcl-2 1.29±0.29 0.77±0.10#1.21±0.44*1.08±0.26 0.94±0.35 Bax 0.72±0.04 1.06±0.26##0.75±0.21*0.76±0.14*0.92±0.23

    表2 PNS對缺氧復(fù)氧致CNC損傷神經(jīng)元caspase-3活性的影響

    4 討論

    Bcl-2、Bax同屬于B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族,但卻具有相反的作用,前者可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,后者能夠促進凋亡的發(fā)生。Bcl-2與Bax結(jié)合形成異源二聚體使其失活,當(dāng)Bcl-2磷酸化,Bax表達增多或是Bad取代Bax與Bcl-2結(jié)合后,Bax隨即獲釋而形成誘導(dǎo)死亡的同源二聚體,進入線粒體破壞其膜的通透性,將細(xì)胞色素C和Apaf-1釋放至胞漿[1-2]。在ATP存在的情況下,細(xì)胞色素C能與Apaf-1形成復(fù)合體,該復(fù)合體可以活化caspase-9,再激活caspase-3,啟動caspase級聯(lián)反應(yīng),通過特異性地裂解其底物而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2較多時,Bcl-2和Bax的異源二聚體增多,凋亡趨勢減弱;當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax較多時,Bax本身形成的同源二聚體占主導(dǎo),則易于發(fā)生凋亡。所以Bcl-2/Bax比值對于決定細(xì)胞是否進入凋亡狀態(tài)具有重要意義。PNS可以抑制促凋亡基因Bax的表達,增加抑制凋亡基因Bcl-2。一方面,Bcl-2可以Bcl-2和Bax的形成異源二聚體,直接發(fā)揮抗凋亡作用,另一方面,可以調(diào)節(jié)線粒體MPTP的開閉。線粒體是Bcl-2蛋白和Bax蛋白在細(xì)胞內(nèi)的主要分布部位,Bcl-2蛋白對線粒體主要功能之一是通過調(diào)節(jié)線粒體膜上的MPTP[7],線粒體MPTP孔位于富含Bax、Bcl-2的地方。由于Bax和Bcl-2有不同的離子選擇性,Bax促進MPTP孔開放,釋放CytC,激活caspase級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Bcl-2、抑制MPTP孔開放,阻止細(xì)胞凋亡。

    研究結(jié)果顯示,在適宜的濃度范圍內(nèi),PNS使Bcl-2基因的表達上調(diào),Bax基因的表達下調(diào),PNS有抑制caspase-3mRNA的表達,抑制caspase-3活性的趨勢,進而調(diào)節(jié)線粒體膜上的凋亡相關(guān)蛋白,一方面,減少線粒體膜電位喪失,抑制MPTP的開放,另一方面直接抑制凋亡的發(fā)生;PNS可能是通過上述途徑,調(diào)節(jié)了線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上,凋亡相關(guān)的幾個環(huán)節(jié),而發(fā)揮抗凋亡作用的。

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