豬細(xì)小病毒核衣殼VP2蛋白單克隆抗體的制備及部分特性鑒定

劉秀芬,李一經(jīng)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

豬細(xì)小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一。懷孕母豬,特別是初產(chǎn)母豬感染后以流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡為臨床特征。因該病流行面廣、危害嚴(yán)重,給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。

PPV屬無囊膜病毒,衣殼蛋白即是病毒表面的結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP2蛋白在病毒感染發(fā)生,病毒致病性發(fā)揮以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)等方面起著關(guān)鍵作用[1]。Tullis G E等研究表明,缺失VP2蛋白的突變體也喪失了對(duì)宿主細(xì)胞的再感染性[2]。因此豬細(xì)小病毒VP2蛋白無論在免疫防治、疾病檢測(cè),還是探討疾病發(fā)生機(jī)理均是重要的結(jié)構(gòu)蛋白。

基于豬細(xì)小病毒VP2蛋白功能特性的重要性,本研究以重組VP2蛋白為免疫原,通過細(xì)胞融合技術(shù),制備抗VP2特異性單克隆抗體,并對(duì)單抗和分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行鑒定,為該病及其病原的基礎(chǔ)性或應(yīng)用性研究提供重要的研究工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)8～10周齡BALB/c小鼠,購(gòu)自黑龍江省醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 免疫原 表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白重組干酪乳桿菌pPG-1-VP2-E290/L.casei393,由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[3]表達(dá)的VP2蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳,切膠純化,PBS稀釋成所需濃度。

1.3 細(xì)胞系 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、ST傳代細(xì)胞,購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心。

1.4 病毒 豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)、豬輪狀病毒(PRV)細(xì)胞培養(yǎng)毒,由本實(shí)驗(yàn)室分離,-20℃凍存。

1.5 主要試劑 完全與不完全弗氏佐劑、PEG3350、IgG抗體亞類試劑盒均購(gòu)自Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗鼠IgG均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.6 動(dòng)物免疫 8～10周齡BALB/c小鼠進(jìn)行3次腹腔免疫,每次間隔2周,在最后一次免疫3天后取脾臟用于細(xì)胞融合。首免抗原為50 μ g重組PPV VP2蛋白PBS與等量弗氏完全佐劑,第2次加強(qiáng)免疫為相同抗原加弗氏不完全佐劑,第3次加強(qiáng)免疫為相同抗原不加佐劑。

1.7 細(xì)胞融合 以50%PEG3350為融合劑,脾細(xì)胞與SP2/0按8∶1進(jìn)行融合[6]。每孔脾細(xì)胞數(shù)不少于1×105個(gè)。

1.8 單抗篩選 以PPV細(xì)胞培養(yǎng)物作為檢測(cè)抗原,對(duì)融合細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè),鼠抗PPV VP2血清為陽性對(duì)照,SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照,P/N值大于2判為陽性。陽性孔細(xì)胞通過3～4次克隆篩選后,擴(kuò)大培養(yǎng),凍存。

1.9 腹水單抗制備 將BALB/c小鼠腹腔注入液體石蠟,劑量為0.5 mL/只,7～10 d后腹腔注入雜交瘤細(xì)胞約1×105個(gè)/只,7～15 d后待腹圍明顯增大后用注射器多次收集腹水,低速離心后,收集上清,所得細(xì)胞適當(dāng)稀釋注入另一只小鼠體內(nèi)繼續(xù)生產(chǎn)腹水抗體。間接ELISA測(cè)定腹水抗體效價(jià)。

1.10 染色體數(shù)測(cè)定 將各株雜交瘤細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞分別制備細(xì)胞染色體[5],每個(gè)細(xì)胞取10個(gè)形態(tài)完整、單在,染色體分散良好、無重疊、無散失的制片樣本進(jìn)行觀察,計(jì)數(shù),求出平均染色體數(shù)。

1.11 單克隆抗體亞類鑒定 按抗體亞類試劑盒說明書測(cè)定。

1.12 Western blot分析 表達(dá)細(xì)小病毒VP2 pPG-1-VP2-E290/L.casei393誘導(dǎo)后,進(jìn)行 SDSPAGE,半干轉(zhuǎn)印后,各雜交瘤細(xì)胞上清液分別進(jìn)行Western blot抗體檢測(cè)。

1.13 間接免疫熒光法鑒定 接種病毒的ST細(xì)胞,待出現(xiàn)CPE后,倒去培養(yǎng)上清液,刮取細(xì)胞培養(yǎng)物涂片,干燥,冷丙酮固定10 min,0.01 mol/L pH 7.2 PBS洗滌3次,每次3 min,以后分別加雜交瘤細(xì)胞上清液和0.01%伊文思藍(lán)稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37℃60 min,相同方法洗滌,干燥后,鏡檢觀察[6]。

1.14 單克隆抗體與相關(guān)病毒的反應(yīng)性 PPV、PEDV、TEGV和PRV細(xì)胞培養(yǎng)物為包被抗原,間接ELISA檢測(cè)各株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株建立 經(jīng)過多次克隆和篩選獲得了5株分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別是2D5、1F11、2B4、3C8和1H3。這5株單抗細(xì)胞上清效價(jià)分別為1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶800、1∶800,腹水抗體效價(jià)分別為1∶106、1∶105、1∶104、1∶104、1∶104,結(jié)果表明,腹水效價(jià)明顯高于上清效價(jià),體外連續(xù)傳代培養(yǎng)3個(gè)月及凍存后復(fù)蘇均不影響抗體的分泌。說明建立的雜交瘤細(xì)胞具有穩(wěn)定分泌抗體能力。

2.2 染色體數(shù)測(cè)定結(jié)果 染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明,分泌抗體細(xì)胞平均染色體數(shù)目為87～102條,SP2/0骨髓瘤細(xì)胞是56～57條,兩者染色體數(shù)目相差明顯,說明篩選的細(xì)胞是屬于雜交瘤細(xì)胞。

2.3 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果 抗體亞類鑒定結(jié)果顯示,2D5分泌抗體為IgG2a型,其余4株1F11、2B4、3C8、1H3均為 IgM 型。

2.4 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

2.4.1 Western blot分析 以雜交瘤細(xì)胞株Western blot檢測(cè),表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組干酪乳桿菌pPG-1-VP2-E290/L.casei393經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,進(jìn)行的Western blot分析表明,5株單抗反應(yīng)后均可在約70 kDa出現(xiàn)反應(yīng)帶,大小與預(yù)期結(jié)果相符[7],說明所制備的單抗是針對(duì)豬細(xì)小病毒VP2蛋白(見圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)單克隆抗體

圖2 5株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)感染PPV的ST細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光染色結(jié)果

2.4.2 間接免疫熒光鑒定結(jié)果 以PPV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)制備的5株單抗進(jìn)行的間接免疫熒光反應(yīng)結(jié)果表明,2D5、1F11、2B4、3C8 、1H3,感染病毒的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亮綠色熒光反應(yīng),而SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液染色未出現(xiàn)熒光,(見中插彩版圖2),說明所制備的單抗能與PPV發(fā)生反應(yīng)。

2.4.3 單克隆抗體與其他相關(guān)病毒的交叉反應(yīng)性間接ELISA結(jié)果表明,5株單抗與PPV反應(yīng)的OD值明顯高于PEDV、TGEV和PRV。從接種病毒和未接種病毒的P/N值結(jié)果看,5株單抗與PPV反應(yīng)的 P/N值均大于 2,而與 PEDV、TGEV和PRV反應(yīng)的P/N值大約在1左右(見表1)。上述結(jié)果說明,制備獲得的5株單抗與PEDV、TGEV和PRV不發(fā)生交叉反應(yīng),對(duì)PPV具有較強(qiáng)的特異性。

表1 單抗特異性鑒定結(jié)果

3 討論

單克隆抗體以其均質(zhì)性高、特異性強(qiáng)、易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等特點(diǎn),已成為生物領(lǐng)域基礎(chǔ)性或應(yīng)用性研究的一種重要的工具。本試驗(yàn)通過細(xì)胞融合技術(shù),經(jīng)過多次克隆篩選獲得了抗體效價(jià)高、分泌功能穩(wěn)定的5株雜交瘤細(xì)胞株,通過Western blot檢測(cè)表明,5株單抗均識(shí)別豬細(xì)小病毒VP2蛋白;間接免疫熒光鑒定和與其他相關(guān)病毒的交叉反應(yīng)性也表明,制備的5株單抗具有與豬細(xì)小病毒高度反應(yīng)的特異性,從而為開發(fā)利用這些單抗,進(jìn)行豬細(xì)小病毒及其疾病的基礎(chǔ)性或應(yīng)用性研究提供了重要的工具。5株單抗是否識(shí)別豬細(xì)小病毒VP2的不同表位以及制備的單抗是否具有中和病毒作用,值得深入探討。

不同抗體亞類出現(xiàn)的時(shí)間與免疫發(fā)生的不同時(shí)期有一定關(guān)系,在免疫發(fā)生的早期,出現(xiàn)的循環(huán)抗體以IgM類為主,隨后出現(xiàn)IgG類。兩類抗體在純化手段,與相應(yīng)抗原的親和力方面存在差別,目前對(duì)IgG類抗體的純化方法相對(duì)成熟,而對(duì)IgM的純化方法、抗體純化效率均不是令人滿意。本次融合篩選獲得的抗體亞類多以IgM 類為主,只有其中1株為IgG類,是否與最后一次加強(qiáng)免疫較早取脾細(xì)胞融合有一定關(guān)系,適當(dāng)推遲融合時(shí)間可能對(duì)提高IgG類的篩選獲得具有幫助。

利用全病毒為免疫原是制備單克隆抗體的常規(guī)方法。本試驗(yàn)采用純化的重組PPV蛋白為免疫原,因刺激抗原成分單一,提高了針對(duì)目的抗原陽性雜交瘤細(xì)胞株篩選的頻率;避免了以PPV全病毒抗原為免疫原制備單克隆抗體篩選過程中的大量繁瑣工作和篩選結(jié)果的不確定性,也減少了大量培養(yǎng)和純化病毒的繁瑣過程和排散病毒的危險(xiǎn)。

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