豬傳染性胸膜肺炎的診斷技術(shù)

謝芳，張艷禾，司微，劉思國，王春來

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物細(xì)菌病研究室， 黑龍江哈爾濱 150001）

豬傳染性胸膜肺炎（PCP），是一種高度傳染性、致死性的呼吸系統(tǒng)傳染病。該病的主要特征是急性與亞急性病例呈現(xiàn)纖維素性出血性胸膜肺炎、慢性病例呈現(xiàn)纖維素性壞死性胸膜肺炎。1957年，英國人Pattison等首次發(fā)現(xiàn)該病，目前已在世界各國廣泛流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，成為國際公認(rèn)的危害現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一。隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展，本病的發(fā)生呈暴發(fā)趨勢，并且近年來該病常與其它呼吸系統(tǒng)疾病繼發(fā)感染或混合感染，如該病與豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬支原體肺炎、豬肺疫、副豬嗜血桿菌病等混合感染，加重了其危害性。目前，該病引起了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，是豬細(xì)菌性傳染病研究的熱點(diǎn)之一。1987年，哈爾濱獸醫(yī)研究所首次在我國報(bào)道該病，此后在許多省市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病。2006年，對(duì)洛陽地區(qū)規(guī)?；i場進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，陽性率為30.39%，2009年，對(duì)四川部分地區(qū)的1062份非免疫豬血清進(jìn)行檢測，平均陽性率為18.5%。

一、病原學(xué)

該病的致病菌是胸膜肺炎放線桿菌（APP），最初被稱為副溶血嗜血桿菌或胸膜肺炎嗜血桿菌。1953年，Pohl等通過DNA雜交試驗(yàn)表明，該菌與林氏放線桿菌關(guān)系密切，因此將其劃歸于巴氏桿菌科，放線桿菌屬，并命名為胸膜肺炎放線桿菌。

（一）生物學(xué)特性 APP為革蘭氏陰性球桿菌，具有多形態(tài)，常呈小桿菌或球桿菌。兼性厭氧，具有莢膜和纖毛，不形成芽孢。近年來研究發(fā)現(xiàn)該菌有鞭毛，具有運(yùn)動(dòng)性，長約3μm，寬約0.5μm 。

APP的培養(yǎng)特性：該菌生長的最適溫度為37℃，最佳pH值為7.6～7.8，供給5%～10%CO2會(huì)促進(jìn)其生長發(fā)育。該菌營養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂平板不生長，最適生長的培養(yǎng)基為巧克力瓊脂平板、綿羊血瓊脂平板及馬血清肉湯平板等。該菌對(duì)外界環(huán)境條件抵抗力不強(qiáng)，不能在外界環(huán)境中持續(xù)存在，60℃加熱15 min即死亡，對(duì)日光、干燥和一般化學(xué)消毒劑抵抗力低，1%漂白粉、1:100百毒殺都可在2 min使其滅活。但對(duì)結(jié)晶紫、桿菌肽、壯觀霉素和林肯霉素等有一定的抵抗力。

APP的形態(tài)特征：該菌在綿羊鮮血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈圓型、針尖大小、邊緣整齊、中間稍凸，呈β溶血；以同樣條件在巧克力瓊脂平板上培養(yǎng)，菌落形態(tài)會(huì)稍大。在綿羊鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)，金黃色葡萄球菌的劃線兩側(cè)，能夠加重溶血區(qū)，稱為“cAMP”現(xiàn)象。將1%NAD液交叉劃線于馬血清肉湯瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18 h后，畫線近端處的菌落生長旺盛，遠(yuǎn)端生長較少，稱為“衛(wèi)星”現(xiàn)象，此為該菌生物Ⅰ型的典型特征。生物Ⅱ型不需要NAD就可生長，其它特征同生物Ⅰ型。

（二）血清分型 根據(jù)APP的生長是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，又稱V因子），可將APP分為生物I型和生物Ⅱ型。生物I型生長需要NAD，生物Ⅱ型生長可不需要NAD，但需要其它特定的吡啶核苷酸或其前體以合成NAD。

根據(jù)APP表面莢膜（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性的不同，可將APP分為15個(gè)血清型，血清1型又分為1a和1b兩個(gè)亞型，血清5型又分為5a和5b兩個(gè)亞型；血清型1～12、15屬于生物I型，血清型13、14屬于生物Ⅱ型。此外，還有一些分離到的APP依據(jù)現(xiàn)在的分類系統(tǒng)還不能劃分其血清型。

APP的15種血清型都能致病，但毒力存在明顯差異，其中血清型1、5、9和11被認(rèn)為毒力最強(qiáng)，常見于急性暴發(fā)、高死亡率和肺臟出現(xiàn)嚴(yán)重病變；其它血清型的毒力較弱，被認(rèn)為毒力最低的是血清3型和6型。

APP不同血清型的免疫原性也存在很大的差別，血清型間不存在交叉保護(hù)，針對(duì)某一血清型的滅活苗無法對(duì)APP其它血清型提供保護(hù)。然而有些血清型的菌株之間有相似的膜蛋白或脂多糖成分，引起了血清學(xué)交叉反應(yīng)，給該病的分型診斷造成了一定的困難，如在血清型l與7之間，l、9及11之間，3、6及8之間，4與7之間。

二、流行病學(xué)

該病分布廣泛，流行于世界各國。各個(gè)國家和地區(qū)流行的血清型不同，如歐洲流行的血清型主要為1、2、5、7和9型；美國流行的血清型主要為l、5和7型；加拿大流行的血清型主要為1、3和5型；日本流行的血清型主要為5、6和7型；我國流行的血清型主要為1、3、5和7型。隨著各國之間引進(jìn)種豬的不斷增多，血清型也更復(fù)雜。一些國家或地區(qū)可能同時(shí)流行多個(gè)血清型，甚至同一豬場內(nèi)還可能存在不同血清型。存在于我國的APP血清型非常多，目前已發(fā)現(xiàn)并分離到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多種血清型。

該病于氣候驟變時(shí)多發(fā)，如冬末春初或夏末秋初；夏季也時(shí)有發(fā)生。飼養(yǎng)條件差可誘發(fā)該病，如飼養(yǎng)密度過高、圈舍潮濕、通風(fēng)不良、塵埃多等不良因素。各種年齡的豬均對(duì)APP易感，3～4月齡豬多發(fā)，成年種公母豬也有散發(fā)。

該病主要由空氣傳播、接觸病豬及其污染物傳播，引進(jìn)帶菌豬或慢性感染豬是其最主要的傳播途徑，從而造成未感染該病的豬群發(fā)病。1988年，朱士盛等對(duì)10個(gè)省份的296頭進(jìn)口豬進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)陽性率為26.7%，表明該病在我國的發(fā)生與引種有密切關(guān)系。

近年來，該病常與豬藍(lán)耳病、豬支原體肺炎、豬偽狂犬病、豬肺疫、豬瘟、副豬嗜血桿菌病等混合感染，導(dǎo)致病情加重，死亡率升高。一般來說，該病受氣候環(huán)境、飼養(yǎng)條件的影響，發(fā)病率和死亡率差異很大，分別在8.5%～100%和0.4%～100%。

三、臨床癥狀和病理變化

APP隨氣流進(jìn)入呼吸道，在肺泡內(nèi)定居、增殖并產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致纖維素性出血性胸膜肺炎?；疾∝i的主要病變在胸腔內(nèi)，典型特征是呈現(xiàn)纖維素性、出血性和壞死性肺炎。

最急性病例臨床表現(xiàn)為突然發(fā)病，體溫高達(dá)41℃，沉郁，食欲不振，并出現(xiàn)嘔吐和腹瀉，臥地不起，呼吸困難，張口呼吸，口鼻腔流出泡沫樣液體，呈紅色，多于24～36 h內(nèi)死亡。病理變化：肺部呈紅色腫脹，表面出現(xiàn)出血點(diǎn)，呈粟粒大小；肺切面多汁，流出紅色液體，氣管腔內(nèi)充滿泡沫樣紅色液體。有些病例肺小葉間質(zhì)明顯增寬。

急性病例臨床表現(xiàn)為體溫高達(dá)41℃～42℃，呈稽留熱，精神高度萎靡，食欲漸少乃至廢絕。呈現(xiàn)出不同程度的呼吸困難，表現(xiàn)為呼吸加快、張口呼吸呈犬坐式，且伴有咳嗽和呻吟。黏膜呈現(xiàn)潮紅或紫紅色，鼻腔流出漿液或粘液性棕紅色鼻液。耳鼻、四肢、腹下等處淤血。多數(shù)病豬于2～3 d內(nèi)窒息死亡。少數(shù)病豬出現(xiàn)腹瀉和嘔吐癥狀。部分病豬如果及時(shí)治療可以轉(zhuǎn)歸痊愈。病理變化：胸腔內(nèi)出現(xiàn)大量積液，呈黃色或紅黃色。肺葉腫大，肺膜增厚、粗糙，多數(shù)病例肺葉出現(xiàn)大小不一的斑塊，呈紫紅色，嚴(yán)重病例肺臟呈紫紅色病變，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，有些病例肺葉部分區(qū)域出現(xiàn)大理石狀條紋，呈紫紅色、灰紅色和灰白色相間，質(zhì)硬如肝。

亞急性和慢性病例多是由于急性病例治療不當(dāng)轉(zhuǎn)化而來所造成的，臨床表現(xiàn)為食欲減退、消瘦、間歇性咳嗽，易繼發(fā)感染其它病原而使癥狀加重甚至導(dǎo)致死亡。某些病例母豬流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎，并且豬體不同部位出現(xiàn)膿腫。病理變化：肺臟呈現(xiàn)大小不等、由結(jié)締組織包裹的壞死性結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)處胸壁和肺臟粘連，切開會(huì)流出灰白色膿樣物。嚴(yán)重病例心包、心外膜、胸膜、肺以及膈肌等多處廣泛粘連。有時(shí)還伴有全身廣泛性淤血和出血、出血性淋巴結(jié)炎和急性脾炎等變化。

四、診斷

對(duì)APP的診斷與檢測主要是通過病原學(xué)、血清學(xué)或分子生物學(xué)的方法。

（一）病原學(xué)診斷方法 傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法主要是對(duì)APP分離與鑒定。一般是從病豬的鼻腔、支氣管、肺臟病變組織處或胸水等處進(jìn)行分離。所用培養(yǎng)基需要營養(yǎng)豐富，一般該菌可在巧克力瓊脂平板或綿羊血瓊脂平板上分離出。經(jīng)形態(tài)染色、生化試驗(yàn)、呈現(xiàn)“cAMP”及“衛(wèi)星”現(xiàn)象、溶解綿羊血、尿素酶試驗(yàn)陽性，可鑒定為APP生物Ⅰ型菌株，如果生長時(shí)還不需要NAD，可鑒定為生物Ⅱ型菌株?？赏瑫r(shí)結(jié)合協(xié)同凝集試驗(yàn)或瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等血清學(xué)診斷方法做確診，或是結(jié)合PCR等分子生物學(xué)診斷方法做確診。

此外，免疫磁珠法是一種新出現(xiàn)的APP分離方法。1998年，Gagne等用免疫磁珠法從感染血清1型的豬體中分離到APP，該方法是先用特異性多克隆抗體或單克隆抗體包被磁珠，再將磁珠與病料相互作用，在磁場作用下分離出該菌。2001年，Angen等也用免疫磁珠法從血清2型感染豬體中分離到APP。相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法，免疫磁珠法更準(zhǔn)確和簡便，并且比PCR方法更靈敏，但對(duì)儀器設(shè)備要求較高，因此不適于基層廣泛應(yīng)用。

（二）血清學(xué)診斷方法 APP的血清學(xué)診斷方法主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。

1.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）是由Nicolet于1971年首次將其用于檢測APP并迅速成為APP分型的最早標(biāo)準(zhǔn)方法。CFT的敏感性和特異性較好，檢出率可達(dá)100%，感染APP兩周后就可檢出抗體，因此多年來被用于APP的檢測，并且該方法能夠區(qū)分與APP親緣關(guān)系較近的細(xì)菌，如副豬嗜血桿菌等。但CFT操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以一般只在實(shí)驗(yàn)室中使用。

2.間接血凝試驗(yàn)（IHA）是由Mittal于1983年建立并將其用于APP檢測和分型。1990年，Mittal等發(fā)現(xiàn)凝集試驗(yàn)和COA不能區(qū)分血清1型和9型，而IHA卻能區(qū)分二者。

3.協(xié)同凝集試驗(yàn)（COA）是一種簡單快速的APP檢測和分型的方法。1988年，Mittal等 將2-疏 基乙醇試管凝集、COA和瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)合并用于APP檢測，可以區(qū)分血清6型與其它血清型。1991年，Mittal等發(fā)現(xiàn)需要結(jié)合應(yīng)用COA和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)以區(qū)分血清4型和7型。相比于IHA和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，COA簡單、快速，特異性較高，適于臨床推廣應(yīng)用。

4.乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）是一種快速簡捷的APP檢測和定型方法。1992年，Inzana等首次將LAT引入到APP的檢測中，并發(fā)現(xiàn)LAT能區(qū)分血清l型和9型。1995年，Inzana提出一種改進(jìn)的乳膠凝集試驗(yàn)方法，該方法靈敏度高、特異性好，不與多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬放線桿菌交叉反應(yīng)，并且該方法不需要大量儀器設(shè)備，非常適于快速臨床檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

5.瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)又稱免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，能輔助其它試驗(yàn)區(qū)分交叉反應(yīng)的APP血清型，如協(xié)同凝集試驗(yàn)或2-疏基乙醇試管凝集等。但瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的敏感性和特異性都不如ELISA。

6.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是近年來檢測APP的最常用的血清學(xué)診斷方法。1981年，Nicolet等首次用ELISA試驗(yàn)對(duì)APP進(jìn)行分型。1992年，Trottier等制定了一個(gè)鑒別APP血清5型的ELISA試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)草案。目前，ELISA已經(jīng)成為檢測APP的主要方法之一。

（三）分子生物學(xué)診斷方法 PCR技術(shù)是用于檢測APP的主要分子生物學(xué)診斷方法。由于PCR技術(shù)的快速、簡便、靈敏性高、特異性好和無交叉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，使得近年來PCR方法成為國內(nèi)外檢測APP的最主要的方法。目前，國內(nèi)外己經(jīng)建立了多種PCR檢測方法用于豬傳染性胸膜肺炎的早期診斷和APP的快速鑒定。1995年，F(xiàn)rey等建立了基于Apx的PCR檢測方法，并能將所有APP血清型區(qū)分為4種Apx類型，不僅提高了APP檢測率和流行病學(xué)調(diào)查的效率，還有助于發(fā)現(xiàn)非典型的溶血素分子結(jié)構(gòu)。1995年，Gram和Ahrens建立了基于omlA基因的PCR檢測方法，具有較高的種特異性和敏感性。2001年，Schaller等建立了基于apxⅣA基因的PCR檢測方法，特異性和敏感性均很高。2009年，Yang等針對(duì)apx Ⅳ 基因建立了檢測APP的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，比巢氏PCR敏感十倍，認(rèn)為是高敏感性和特異性的檢測方法。

此外，PCR方法還可以通過血清型特異的引物起到區(qū)分血清型的作用。一直以來，國內(nèi)外很多學(xué)者都在研究和改進(jìn)APP的PCR分型系統(tǒng)。2000年，de la Puente-Redondo等建立了基于tbpA和tbpB基因的PCR-RFLF診斷與分型方法，具有較高的種特異性和敏感性，能同時(shí)將所有APP血清型分為10個(gè)RFLP類型，但無法區(qū)分血清型4和11、血清型7和9。2000年，Gram等建立了基于溶血素和omlA基因的PCR診斷與分型方法，能區(qū)分大多數(shù)APP血清型，但不能區(qū)分血清型1和9、血清型2、8和11。此后，研究者還建立了多種多重PCR方法能同時(shí)分型檢測幾種不同的血清型，并能區(qū)分具有血清交叉反應(yīng)的血清型，如血清型2、5和6，血清型1、2和8，血清型1、7和12，血清型3、6和8，血清型1、2和5。

此外，還有許多正在處于研究階段的新方法，如抗APP單克隆抗體的制備、APP膠體金診斷試紙條的研制、基因芯片檢測方法，這些方法既方便又快捷，可用于大規(guī)模的APP檢測，既能確定種又能分型鑒定，有良好的應(yīng)用前景。

（略）